HBZ蛋白通過抑制C-EBPα信號(hào)通路促進(jìn)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、人類T淋巴細(xì)胞白血病1型病毒(HTLV-1)是成人T細(xì)胞白血病(ATL)的致病病原。其中由HTLV-1病毒反義鏈編碼的HBZ蛋白在ATL發(fā)病過程中扮演著關(guān)鍵角色。HBZ蛋白通過調(diào)控多條腫瘤相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生。研究顯示，HBZ具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但具體機(jī)制不詳。C/EBPα蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、腫瘤形成以及宿主免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。C/EBPα蛋白作為腫瘤抑制因子具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

2、。前期研究發(fā)現(xiàn)HBZ可抵消C/EBPα對(duì)T細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。和HBZ蛋白一樣，C/EBPα同樣含有bZIP結(jié)構(gòu)域。已有的報(bào)道顯示，HBZ可與bZIP蛋白相互結(jié)合參與調(diào)節(jié)多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而影響機(jī)體內(nèi)的各種生物學(xué)過程。這提示HBZ可能通過調(diào)控C/EBPα蛋白從而抑制C/EBPα信號(hào)傳導(dǎo)。
　　為了揭示HBZ蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)理，本研究從細(xì)胞和分子水平研究HBZ蛋白對(duì)C/EBPα信號(hào)通路的調(diào)控作用，進(jìn)而揭示HBZ促進(jìn)

3、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制。主要內(nèi)容如下:
　　第一部分: C/EBPα在ATL中異常高表達(dá)
　　首先，運(yùn)用real-time PCR檢測(cè)到與陰性對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞相比，6種HTLV-1感染細(xì)胞株MT-4、MT-1、TL-Om1、43T-、ED、ATL-2中CEBPA mRNA的表達(dá)水平明顯較高。利用Western blot技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了C/EBPα蛋白在ATL細(xì)胞株43T-和MT-4中高表達(dá)。同時(shí)運(yùn)用real-time P

4、CR檢測(cè)了3例正常人和6例ATL臨床病人樣品中CEBPA mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常人相比C/EBPα在ATL患者中異常高表達(dá)。
　　第二部分:HBZ通過激活CEBPA基因啟動(dòng)子從而促進(jìn)C/EBPα表達(dá)
　　為了研究C/EBPα在 ATL中異常高表達(dá)的分子機(jī)制，首先采用real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CEBPA mRNA在穩(wěn)定表達(dá)HBZ的Kit225細(xì)胞株中明顯高表達(dá)。同時(shí)運(yùn)用real-timePCR檢測(cè)到在HB

5、Z轉(zhuǎn)基因鼠CD4+細(xì)胞中CEBPA基因同樣高表達(dá)。隨后，為了進(jìn)一步研究HBZ上調(diào)C/EBPα的分子機(jī)制，我們克隆了CEBPA基因的啟動(dòng)子核心區(qū)。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HBZ可激活CEBPA基因啟動(dòng)子的活性。而且染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示HBZ可直接結(jié)合到CEBPA基因啟動(dòng)子區(qū)域上。以上結(jié)果表明HBZ通過激活CEBPA基因啟動(dòng)子從而促進(jìn)C/EBPα表達(dá)。
　　第三部分:HBZ通過與C/EBPα結(jié)合從而抑制C/EBPα信

6、號(hào)通路
　　為了研究HBZ對(duì)C/EBPα信號(hào)通路的調(diào)控功能，首先運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在Jurkat細(xì)胞中過表達(dá)HBZ可明顯抑制C/EBPα信號(hào)通路，且該抑制作用呈劑量依賴性。同時(shí)為了進(jìn)一步研究HBZ抑制C/EBPα信號(hào)通路的分子機(jī)制，通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HBZ可以與C/EBPα蛋白結(jié)合。最后，運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBZ抑制了C/EBPα蛋白的DNA結(jié)合能力。因此，HBZ可通過結(jié)合C/EBPα蛋白從而抑制C/E

7、BPα信號(hào)通路。
　　第四部分:HBZ通過調(diào)控C/EBPα靶基因從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)
　　為了進(jìn)一步研究HBZ通過抑制C/EBPα通路促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞水平上HBZ能顯著改變C/EBPα靶基因中與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。其中HBZ上調(diào)了腫瘤標(biāo)志基因E2F1、DHFR、PCNA和IL6的表達(dá)，下調(diào)了抑癌基因IL4、IFN-γ的表達(dá)。同時(shí)在HBZ轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HBZ能夠上

8、調(diào)E2F1，PCNA和IL6的表達(dá)。以上結(jié)果提示，HBZ通過改變C/EBPα靶基因中細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫痛細(xì)胞的惡性增生。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HTLV-1編碼的病毒蛋白HBZ通過與C/EBPα蛋白結(jié)合，阻遏其DNA結(jié)合能力，從而抑制C/EBPα信號(hào)傳導(dǎo)通路。首次闡明了HBZ通過對(duì)C/EBPα信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用抵消了 C/EBPα對(duì)ATL細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，從而影響了C/EBPα靶基因中細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，