CD66a對人B-急淋白血病細胞增殖和凋亡的影響及其異常表達機制的研究.pdf

1、前言：
　　白細胞在不同分化階段和活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記叫白細胞分化抗原，現(xiàn)以CD(cluster of differentiation)命名。研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞和腫瘤細胞所表達的CD抗原不同，并且CD抗原與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，其中與白血病的相關(guān)性尤其令人重視。多項報道表明CD66就是一種異常表達于急性B淋巴細胞白血?。˙-急淋）的膜分化抗原。正常情況下CD66表達只局限于髓細胞，淋巴細胞不表達CD66，

2、但多位研究者卻在B-急淋病例中發(fā)現(xiàn)癌變的B淋巴細胞表面有CD66表達。CD66又分為CD66a-CD66e亞型，其中CD66a和CD66c是異常表達于B-急淋白血病細胞的主要亞型。
　　CD66a，又名CEACAM1，是CEACAM家族的跨膜粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族。CD66a作為CD66家族的主要亞型異常表達于B-急淋白血病細胞中雖然已廣泛報道，但這種異常表達引起的功能效應(yīng)及其表達機制卻尚無報道。CD66a的一個重要特性是

3、它在某些癌細胞中抑制腫瘤生長，但在另外一些癌中如甲狀腺癌、非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤等卻促進腫瘤進行性生長，并與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良高度相關(guān)。鑒于CD66a在癌細胞中的矛盾作用，它在B-急淋白血病細胞中的生物學(xué)功能及異常表達機制值得研究，因此本課題采用CD66a(+)的B-急淋白血病細胞系BALL-1分析CD66a對B-白血病細胞增殖和凋亡的影響。
　　另外，為了研究CD66a表達機制，通過生物信息學(xué)軟件分析，CD66a可能受轉(zhuǎn)錄因子P

4、U.1調(diào)控。PU.1是造血系統(tǒng)的中心調(diào)控因子，不僅調(diào)節(jié)血細胞的正常分化，對白血病的發(fā)生也具有重要意義，其異常表達能導(dǎo)致白血病發(fā)生，因此選定PU.1抗體通過染色體免疫共沉淀-測序法(ChIP-sequencing)來檢測PU.1在CD66(+)的B-急淋白血病細胞系BALL-1及CD66(-)的正常B淋巴母細胞系HMy2.CIR中的靶基因差異表達譜，用以分析PU.1及其調(diào)控的共表達基因與 CD66a的潛在關(guān)系，從而了解CD66a在B-急淋

5、白血病中的異常表達機制，為B-急淋白血病治療新策略提供理論基礎(chǔ)。
　　實驗材料：
　　人急性B淋巴細胞白血病細胞株BALL-1和人B淋巴母細胞HMy2.CIR購于中國科學(xué)院細胞庫。
　　FITC標記的抗-CD66 mAb、小鼠IgG抗體（BD公司）;兔抗人PU.1多克隆抗體(Santa Cruz);小鼠β-actin單克隆抗體(Santa Cruz);兔抗人LFNG多克隆抗體(abcam);兔抗人Hes1多克隆抗體(a

6、bcam); HRP標記的羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗（武漢博士德公司）;
　　DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、1％青鏈霉素(Hyclone);無血清培養(yǎng)基Opti-MEM(Invitrogen); Trizol試劑(Invitrogen);二甲基亞砜(DMSO)、 DAPT(Sigma)
　　RT-PCR試劑盒與SYBR Green QRT-PCR試劑盒(Takara);全蛋白提取試劑盒（南京凱基）;ECL試劑盒(Thermol);細

7、胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物公司）;FITC-annexinⅤ/PI細胞凋亡雙染試劑盒（南京凱基生物公司）;ChIP試劑盒(Millipore);
　　引物合成(Takara); siRNA設(shè)計及合成（蘇州吉瑪基因公司）
　　流式細胞儀(Becton Dickinson，USA); QRT-PCR擴增儀LightCycler(RocheDiagnostics，USA);電轉(zhuǎn)杯(BIO-RAD，USA);電穿孔儀ECM83

8、0(BTX，San Diego，CA);熒光化學(xué)發(fā)光成像分析儀(MF-Chemi BIS)
　　研究方法：
　　1、干擾CD66a功能后檢測細胞增殖及凋亡:在B-急淋細胞系BALL-1細胞中通過用抗體阻斷和siRNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)兩種方法干擾CD66a表達，應(yīng)用細胞周期檢測試劑盒及FITC-annexinⅤ/PI細胞凋亡雙染試劑盒研究CD66a被抑制后對B白血病細胞增殖和凋亡的影響，同時應(yīng)用QRT-PCR檢測了CD66a表達下調(diào)

9、與Fas/FasL的mRNA表達水平變化的相關(guān)性。
　　2、ChIP-sequencing:應(yīng)用PU.1抗體分別對CD66a(+)的BALL-1細胞和CD66a(-)的HMy2.CIR細胞進行ChIP-sequencing，獲取轉(zhuǎn)錄因子PU.1調(diào)控的共表達基因譜。
　　3、篩選差異表達基因:根據(jù)基因表達譜及Gene Ontology和NCBI數(shù)據(jù)庫提供的基因功能信息，選定一組與腫瘤發(fā)生有直接或間接關(guān)系且啟動區(qū)僅在BALL-1

10、中與PU.1結(jié)合而在HMy2.CIR中不與PU.1結(jié)合的基因，應(yīng)用real-time PCR檢測這些選定基因在BALL-1和HMy2.CIR細胞中mRNA水平，篩選出差異表達基因。
　　4、ChIP-PCR驗證ChIP-sequencing結(jié)果:根據(jù)基因譜提供的PU.1與基因結(jié)合的位點數(shù)據(jù)，分別用BALL-1和HMy2.CIR中以PU.1抗體免疫沉淀得到的DNA為模板，擴增上述差異基因與PU.1結(jié)合位點的區(qū)域，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳

11、觀察結(jié)果以驗證ChIP-sequencing可靠性。
　　5、差異基因LFNG與Notch信號對CD66a表達影響的研究:通過siRNA沉默LFNG基因后，用QRT-PCR和Western-blot檢測CD66a及Notch信號通路下游基因Hes1的表達，研究LFNG對Notch通路和CD66a表達的影響。另外，應(yīng)用γ分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號后，檢測Notch通路對CD66a表達的影響，同時檢測CD66a被抑制后對N

12、otch信號通路下游基因Hes1表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1、CD66a對BALL-1細胞的影響:CD66a抗體阻斷CD66a功能及siRNA有效沉默CD66a基因后，BALL-1細胞周期檢測顯示細胞增殖指數(shù)降低伴S期百分比數(shù)減少，凋亡檢測顯示細胞早期凋亡和晚期凋亡百分比均升高。另外，CD66a被干擾后伴隨Fas和FasL mRNA表達水平相應(yīng)升高。
　　2、根據(jù)ChIP-sequencing結(jié)果篩選差異基因:根據(jù)

13、PU.1靶基因表達譜及QRT-PCR結(jié)果，篩選出10個差異表達基因，這些基因的啟動區(qū)僅在BALL-1細胞中與PU.1結(jié)合，而在HMy2.CIR細胞中其啟動區(qū)不與PU.1結(jié)合，且它們在BALL-1細胞中的mRNA水平與HMy2.CIR細胞相比升高123倍至6.2倍不等，其中mRNA表達差異最大的是LFNG基因，為123倍。
　　3、ChIP-sequencing結(jié)果的驗證:ChIP-PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示篩選出的差異基因

14、在BALL-1免疫沉淀的DNA樣品中擴增均為陽性，而在HMy2.CIR免疫沉淀的DNA樣品及相應(yīng)的IgG樣品中擴增均為陰性。
　　4、LFNG基因與Notch通路對CD66a表達的影響:siRNA有效沉默LFNG基因后，Hes1表達下降，Notch通路被抑制，且CD66a表達相應(yīng)下降。DAPT抑制Notch通路后也證實了CD66a表達降低。另外，CD66a基因沉默后，Hes1表達無變化，即CD66a不影響Notch通路。
　

15、　結(jié)論：
　　1、CD66a在B-急淋白血病細胞系BALL-1中的異常表達能促進細胞增殖并降低凋亡，其對凋亡的影響可能與Fas/FasL信號通路有關(guān)。
　　2、ChIP-sequencing結(jié)果可靠，受PU.1調(diào)控的CD66a共表達基因譜提供了與CD66a表達機制有潛在關(guān)系的10個基因:LFNG，F(xiàn)GL2，GAB2，GPR77, CD84,ILRA4, TMBIM1, GNG2, DMXL2, PI3K。
　　3、LF