注射用核糖核酸Ⅱ調(diào)控人白血病細胞增殖凋亡的分子機制研究.pdf

1、白血病是一類以不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱及肝臟、脾臟、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛為臨床表現(xiàn)的造血干細胞惡性克隆性疾病[1]。白血病的發(fā)病機制極為復(fù)雜，與染色體斷裂、易位所引起的癌基因激活、抑癌基因失活等多種因素有關(guān)[2]。盡管目前臨床所采用的骨髓移植、化療等方法在白血病的治療方面取得了極大的進展，但因其治療價格昂貴、配型困難、副作用多等不利因素削弱了這些治療措施對白血病的治療效果，迫切需要尋找價格低廉而療效明顯的藥物。
　　注射用核

2、糖核酸Ⅱ（Ribonucleic acidⅡ）是免疫核糖核酸的成員之一，具有提高細胞免疫功能和抗腫瘤等作用[3]，對肺癌、胃癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抗腫瘤藥物活性[4]，這一作用主要是誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA損傷來實現(xiàn)的。而注射用核糖核酸Ⅱ?qū)τ诎籽〉闹委熜Ч皺C制研究極少見報道。
　　磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphoinositide3-kinases，PI3K）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可磷酸化細胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員[5

3、]。AKT（Protein kinase B，AKT）是一種受磷酸肌醇募集到達質(zhì)膜后激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞存活和凋亡中扮演極其重要角色[6]。PI3K/AKT信號通路可通過激活p53等下游基因影響細胞周期進展、增殖和凋亡，在調(diào)控細胞凋亡增殖過程中發(fā)揮重要作用[7]。p53還可在DNA受損后通過維持基因組穩(wěn)定參與DNA的修復(fù)過程來調(diào)節(jié)細胞的增殖凋亡[8]。因此，PI3K/AKT信號通路對腫瘤細胞DNA的影響是多種抗腫瘤藥物發(fā)

4、揮其作用的重要環(huán)節(jié)。
　　活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的重要分子，參與了體內(nèi)多種病理生理過程；其中，內(nèi)源性的ROS對細胞的凋亡起著重要的作用[9]。研究表明，ROS介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路及其下游信號分子表達水平的改變在多種腫瘤細胞的凋亡過程中與AKT的活化密切相關(guān)[10]。胞內(nèi)ROS水平改變引起很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA片段化導(dǎo)致細胞凋亡[11]。

5、　　因此，探討注射用核糖核酸Ⅱ是否具有誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的作用，這一抗腫瘤作用是否與PI3K/AKT信號通路和ROS有關(guān)，以及二者的關(guān)系可否為注射用核糖核酸Ⅱ的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
　　目的：
　　本研究以人慢性髓系白血病K562細胞和急性髓系白血病KG1a細胞為研究對象，觀察注射用核糖核酸Ⅱ?qū)毎蛲龊椭芷诘挠绊?，研究該藥物對K562和KG1a細胞中ROS水平和PI3K/AKT信號通路分子表達的調(diào)控作用，進一步探討其誘導(dǎo)

6、白血病細胞凋亡的作用機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人白血病細胞系K562和KG1a細胞，分別加入注射用核糖核酸Ⅱ以100～300 mg·L-1連續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h，CCK-8法（Cell counting kit-8，CCK-8）檢測注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細胞增殖的影響；100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細胞24 h后，采用流式細胞術(shù)（Flow cytometr

7、y，F(xiàn)CM）檢測注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細胞凋亡和周期的影響及；Hochest染色后熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；免疫印跡法（Western blot，WB）檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、p53的表達及其下游周期相關(guān)蛋白p21、Cyclin D1、CDK4的表達和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達；WB檢測150 mg·L-1注射用核糖

8、核酸Ⅱ誘導(dǎo)K562和KG1a細胞24 h后，F(xiàn)CM檢測白血病細胞中ROS水平改變以及加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)后p-PI3K、p-AKT和p53蛋白的表達變化，探討注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)白血病細胞凋亡中ROS對PI3K/AKT信號通路影響。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8法結(jié)果顯示：注射用核糖核酸Ⅱ濃度分別采用100、150、200 mg·L-1作用K562和KG1a細胞12、2

9、4和48 h后，K562和KG1a細胞的增殖受到顯著抑制（P＜0.05），且呈時間和濃度依賴性。
　　2.FCM法檢測細胞周期阻滯：K562細胞G0/G1期的周期比例由對照組的22.91%分別增加至28.35%、37.43%、42.40%；KG1a細胞由對照組的23.57%分別增加至28.74%、38.45%、49.77%；細胞周期阻滯在G0/G1期呈濃度依賴（P＜0.05），而G2/M期、S期比例則逐漸減少。
　　3.FC

10、M檢測細胞凋亡：100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)K562和KG1a細胞24 h后,其中K562細胞的凋亡率由空白組4.75%分別增加至為9.21%、15.8%、29.36%；KG1a細胞的凋亡率由空白組6.91%分別增加至為10.06%、56.49%、77.24%；且細胞凋亡率呈濃度依賴性（P＜0.05）。
　　4.Hoechst染色結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的加大，細胞核出現(xiàn)不同程度的染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂

11、、核邊集及染色加深發(fā)出藍白色熒光，表現(xiàn)出細胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變。
　　5.WB結(jié)果顯示：注射用核糖核酸Ⅱ可以明顯上調(diào)p53、p21、Bax和cleaved caspase-3的表達；下調(diào)p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、Bcl-2和Cyclin D1的表達。
　　6.FCM法檢測ROS結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增加，K562和KG1a細胞胞內(nèi)ROS水平均逐漸增高，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）。
　　7.NAC

12、誘導(dǎo)后WB結(jié)果顯示：經(jīng)NAC預(yù)處理后再使用注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)白血病細胞，較只用注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白水平顯著升高了磷酸化PI3K/AKT的表達和降低了p53的表達。
　　結(jié)論：
　　1.注射用核糖核酸Ⅱ具有抑制人急、慢性白血病KG1a和K562細胞增殖，阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。
　　2．注射用核糖核酸Ⅱ可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，激活p53，下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4，阻滯細胞