聯(lián)合鈣離子ATP酶2a和骨髓干細胞移植治療心力衰竭的研究.pdf

1、心力衰竭是各種心臟病的嚴重階段，發(fā)病率和死亡率高，5年存活率和惡性腫瘤相仿。心力衰竭的治療日益受到人們的關注。雖然藥物治療心力衰竭取得一定進展，但療效有限，其它如心臟移植等外科治療存在高風險，費用昂貴等缺陷，因此亟需尋找更為安全有效的治療方法。在心力衰竭的治療策略中，增加心肌細胞數(shù)目和糾正心肌細胞功能是治療的兩個主要方面。本研究以骨髓干細胞為平臺，腺病毒為治療基因載體，聯(lián)合鈣離子ATP酶基因(sarcoplasmicreticulumC

2、a2+-ATPase，SERCa2a)和細胞移植治療慢性充血性心力衰竭。比較單純SERCA2a基因治療，骨髓干細胞移植以及聯(lián)合基因和細胞移植治療心力衰竭的作用，探討SERCA2a基因治療，骨髓干細胞移植治療心力衰竭的可能機制，評價以SERCA2a作為基因治療靶點和骨髓干細胞作為平臺應用于心力衰竭治療的可行性。為尋找慢性心力衰竭尤其終末期心力衰竭的高效安全的治療策略提供思路和實驗基礎。本研究分四個部分進行。 實驗第一部分觀察腺病毒

3、載體轉(zhuǎn)染骨髓干細胞(msenchymalstemcells，MSCs)的有效性和外源性基因表達的時相。體外培養(yǎng)大鼠(SpragueDawley,SD)骨髓干細胞，用已構(gòu)建好的Ad5-CMV-GFP真核載體分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的第3代(P3)及第8代(P8)MSCs。流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后第2，4，7及10天綠色熒光蛋白(GFP)的表達率。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western雜交等方法檢測腺病毒受體(CAR)在各代MSCs中的基因和

4、蛋白質(zhì)的表達。重組腺病毒對MSCs的轉(zhuǎn)染率可達80％，P3與P8代MSCs轉(zhuǎn)染率無明顯差異(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染后2天可見GFP表達，第7天表達水平達高峰，28天仍可見GFP在MSCs中表達。CAR在P1明顯低于P2，P3，P6，P8各代MSCs(P＜0.05)，但P3，P6與P8MSCs表達的CAR無顯著差別(P＞0.05)。重組腺病毒載體能有效轉(zhuǎn)染骨髓干細胞，并維持1個月左右。P3與P8MSCs均可作為基因治療的高效細胞載體。

5、 實驗第二部分以腺病毒(Ad-CMV)介導SERCa2a基因轉(zhuǎn)染MSCs，測定表達產(chǎn)物，為心力衰竭的細胞移植和基因治療提供細胞水平的實驗基礎。體外培養(yǎng)大鼠骨髓干細胞，用已構(gòu)建好的Ad5-CMV-SERCa2a真核載體進行轉(zhuǎn)染。通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR、Western雜交等方法檢測SERCa2amRNA和蛋白質(zhì)的表達。Ad5-CMV-SERCa2a對MSCs的轉(zhuǎn)染率為80％左右，沒有明顯的細胞毒性反應。RT-PCR檢測到

6、SERCa2a，Western雜交確定SERCa2a蛋白表達。腺病毒載體可有效地介導SERCa2a基因轉(zhuǎn)染MSCs，并表達SERCa2a蛋白，為下一階段聯(lián)合細胞移植和基因治療心力衰竭的研究奠定細胞水平的實驗基礎。 實驗第三部分比較SERCA2a基因治療，MSCs移植以及聯(lián)合基因治療和細胞移植治療慢性缺血性心力衰竭的治療效應，評價MSCs作為治療基因轉(zhuǎn)移載體的效率，探討可能的作用機制。制作心力衰竭大鼠模型并隨機分為4組。SERCA

7、2a基因治療組(組Ⅰ，n=7)，MSCs細胞移植組(組Ⅱ，n=7)，聯(lián)合細胞移植和基因治療組(組Ⅲ，n=8)，腺病毒空載體組(組Ⅳ，n=7)。檢測各組SERCA2a基因，蛋白表達及活性。超聲心動圖及有創(chuàng)血流動力學評價心臟功能。HE染色觀察心室形態(tài)。實驗結(jié)果顯示與對照組Ⅳ相比，組Ⅰ(Ad-SERCa2a)，組Ⅱ(MSCs)，組Ⅲ(MSCs.Ad/SERCa2a)心功能和血流動力學明顯改善。治療后組Ⅱ和組Ⅲ大鼠梗死區(qū)面積縮小，室壁厚度增加，

8、心室腔減小。細胞移植組梗死區(qū)血管密度明顯高于非細胞移植。EF14D在組Ⅰ，組Ⅱ與組Ⅲ各組中較治療前分別升高65％，49％和61％，F(xiàn)S14D較治療前分別升高65％，48％和56％(P＜0.05)。EF21D組Ⅰ，組Ⅱ與組Ⅲ較治療前分別升高48％，51％和63％，F(xiàn)S21D較治療前分別升高48％，51％和59％(P＜0.05)。組Ⅳ(Ad)14D心功能無變化，21D心功能顯著下降。組ⅣEF21D及FS21D均較治療前下降18％(P＜0.0

9、1)。21D血流動力學檢測，組Ⅰ，組Ⅱ，組Ⅲdp/dtmax絕對值均高于對照組組Ⅳ(6026.31±280.89mmHg/s，6278.29±318.81mmHg/s，7056.59±388.99mmHg/s，5521.90±267.85mmHg/s，P＞0.01)。組Ⅰ和組ⅢSERCA2a基因，蛋白及酶活性均高于組Ⅱ和組Ⅳ(P＜0.01)。 該部分實驗結(jié)果表明單純SERCA2a基因治療，MSCs移植和聯(lián)合治療均能顯著改善慢性缺

10、血性心力衰竭大鼠心功能和血流動力學。MSCs移植和聯(lián)合治療組大鼠室壁厚度增加，室腔形態(tài)改善。MSCs移植和聯(lián)合治療組大鼠心臟呈現(xiàn)穩(wěn)定持續(xù)的心功能改善作用。而聯(lián)合治療組比單純MSCs移植組大鼠顯示隨時間更為增強的治療效應趨勢。MSCs可以作為治療基因的有效轉(zhuǎn)移載體。SERCA2a基因治療在治療早期表現(xiàn)出最強的心功能增強幅度，但21天后，改善幅度開始下降，可能與所用腺病毒載體有關。在單純SERCA2a基因治療中，SERCA2a表達活性蛋白，

11、糾正異常的鈣離子穩(wěn)態(tài)，增強了心功能。而在聯(lián)合治療中呈現(xiàn)比單純細胞移植隨時間更為增強的治療效應可能與SERCA2a保護移植細胞防止細胞凋亡有關。 實驗第四部分包括兩個實驗探討了骨髓干細胞移植治療慢性心力衰竭的機制。 第四部分實驗一觀察骨髓干細胞移植后對左室重構(gòu)及梗死后瘢痕區(qū)的影響和可能的調(diào)節(jié)機制。結(jié)扎雌性SD大鼠左冠狀動脈制作急性心肌梗死模型。4周后隨機分為移植組(n=7)和對照組(n=7)。將雄性SD大鼠來源的骨髓干細胞

12、(5×106)移植到梗死后瘢痕區(qū)。通過HE染色和Masson染色評價左室形態(tài)。免疫組織化學分析瘢痕區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原，心肌MMP2和TIMP1表達情況。Western雜交檢測MMP2和TIMP1蛋白變化。結(jié)果顯示與對照組相比，移植組大鼠收縮和舒張功能增強。MSCs在移植后21天呈長梭形。移植后早期有炎癥細胞聚集在瘢痕區(qū)，移植后7天炎癥細胞減少，21天可在瘢痕區(qū)觀察到大量微血管形成。左室厚度率增加(76.34±2.66％，64.37±2.36

13、％，P＜0.05)，梗死區(qū)面積縮小(36.19土0.83％，42.12±1.88％，P＜0.05)。移植組大鼠瘢痕區(qū)Ⅰ型膠原表達升高，Ⅲ型膠原降低；心肌MMP2蛋白水平降低而TIMP1水平升高。結(jié)果表明MSCs移植通過MMP2/TIMP1導致瘢痕區(qū)膠原網(wǎng)絡的動態(tài)變化，膠原重建，室壁彈性和僵硬度達到有利于心臟力學的新平衡，從而改善慢性缺血性心力衰竭心臟左室重構(gòu)。 第四部分實驗二研究了MSCs移植對慢性心力衰竭瘢痕周邊及遠隔區(qū)心肌的

14、影響。制作急性心肌梗死SD大鼠。4周后隨機分為移植組(n=7)和對照組(n=7)。將雄性SD大鼠來源的骨髓干細胞(5×106)移植到梗死后瘢痕區(qū)。所有大鼠經(jīng)超聲心動圖和組織多普勒(Dopplertissueimaging，DTI)評價心臟功能和室壁運動。TUNEL染色檢測檢測瘢痕組織邊緣及遠隔區(qū)心肌細胞凋亡情況。HE染色和免疫組化檢測心室形態(tài)和Ⅷ、Bax、Bcl2表達情況。RT-PCR及Western雜交檢測Bax，Bcl2基因和蛋白表

15、達。 該部分結(jié)果表明冠脈結(jié)扎4周后左室前壁，左室后壁，前室間隔和二尖瓣收縮期和舒張期速度均降低。左室前壁收縮期心內(nèi)膜和心肌中層運動速度均明顯下降，舒張期最大平均心肌運動速度在心臟各層均有所下降。與對照組相比，治療后21天移植組心肌收縮及舒張期縱向峰值速度在左室前壁，后壁，前室間隔及二尖瓣水平均顯著升高。對照組和移植組左室前壁、后壁心肌，前室間隔及二尖瓣收縮期縱向峰值速度分別為(0.31±0.02cm/s，0.40±0.01cm/

16、s，0.40±0.01cm/s，0.71±0.02cm/s；0.67±0.02cm/s，2.06±0.15cm/s，1.00±0.08cm/s，2.30±0.14cm/s，P＜0.001)。對照組和移植組左室前壁、后壁心肌，前室間隔及二尖瓣舒張期縱向峰值速度分別為(0.40±0.01cm/s，0.5±0.01cm/s，0.44±0.03cm/s，0.49士0.03cm/s；1.26±0.04cm/s，2.23±0.03cm/s，1.28

17、±0.05cm/s，2.24士0.04cm/s，P＜0.001)。病理切片顯示細胞移植組大鼠瘢痕周邊缺血心肌區(qū)域比對照組大鼠瘢痕周邊缺血心肌區(qū)域縮小。與對照組大鼠相比，移植組大鼠心肌凋亡細胞減少(9.22±1.1個/mm2，28.45±3.6個/mm2，P＜0.001)，移植組瘢痕邊緣區(qū)細胞核密度增加(440.1±136.7，177.75±40.4，P＜0.001)。移植組瘢痕遠隔區(qū)細胞大小比對照組細胞減小(29.49±1.59um2，

18、78.49士3.87um2，P＜0.001)。在瘢痕區(qū)，MSCs移植組可觀察到大量血管形成，部分Hochest3334標記的核藍染細胞表達Ⅷ陽性。與對照組相比，移植組大鼠心臟Bax基因降低，Bcl2基因表達升高。Western雜交檢測Bax，bcl2蛋白表達的結(jié)果與之相符。 研究表明MSCs移植不僅促使瘢痕區(qū)血管新生，改善瘢痕邊緣缺血心肌血供，挽救缺血心肌功能，而且保護心肌細胞拮抗細胞凋亡，防止遠隔區(qū)細胞肥大，逆轉(zhuǎn)遠隔區(qū)心肌應力