特異性阻斷PKCβ2減輕p66shc介導(dǎo)的腸缺血再灌注損傷.pdf

1、背景:細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷中細(xì)胞死亡的主要形式。氧化應(yīng)激條件下，銜接蛋白p66Shc的激活受到PKCβ的調(diào)控，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。PKCβ2的激活與缺血再灌注損傷關(guān)系密切，然而在腸缺血再灌注中，PKCβ2引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。
　　目的:探討腸缺血再灌注損傷中PKCβ2的作用機(jī)制;探討PKCβ2/p66Shc信號(hào)通路在腸缺血再灌注損傷中的作用。
　　方法:
　　1、PKCβ2在腸缺血再灌注損傷

2、中的特異性激活
　　24只雄性ICA小鼠，隨機(jī)分成四組:(A)正常對(duì)照組;(B)腸缺血45分鐘再灌注45分鐘組;(C)腸缺血45分鐘再灌注90分鐘組;(D)腸缺血45分鐘再灌注180分鐘組。構(gòu)建小鼠腸缺血再灌注模型（術(shù)前12h禁食，采取腹腔麻醉，分離腸系膜上動(dòng)脈夾閉阻斷血供，一段時(shí)間后去除夾閉恢復(fù)血供）。
　　2、魯伯斯塔對(duì)腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　24只雄性ICA小鼠，隨機(jī)分成四組:(A)正常對(duì)照組;(B)腸缺

3、血45分鐘再灌注90分鐘組;(C)正常對(duì)照+魯伯斯塔(Ruboxistaurin，PKCβ抑制劑)組;(D)腸缺血45分鐘再灌注90分鐘+魯伯斯塔組。構(gòu)建小鼠腸缺血再灌注模型（術(shù)前12h禁食，采取腹腔麻醉，分離腸系膜上動(dòng)脈夾閉阻斷血供，一段時(shí)間后去除夾閉恢復(fù)血供）。魯伯斯塔給藥組于術(shù)前按每天10mg/kg連續(xù)灌胃給藥，連續(xù)給予三天。
　　3、腸缺血再灌注/缺氧復(fù)氧中PKCβ2對(duì)p66Shc特異性調(diào)控
　　細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)

4、建:Caco-2細(xì)胞于低氧培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)15h(5％CO2、1％O2)，低氧結(jié)束后正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6h。用Lipofectamine2000，將PKCβ2的靶序列siRNA以及陰性對(duì)照序列導(dǎo)入細(xì)胞，作用6h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h。
　　4、PKCβ2/p66shc信號(hào)通路對(duì)腸缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　評(píng)估缺血再灌注后腸道的氧化應(yīng)激狀態(tài)，檢測(cè)腸組織中MnSOD，GSH，GSH-Px和MDA的水平。評(píng)估缺血再

5、灌注后腸道的細(xì)胞凋亡狀態(tài)，檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)目和凋亡標(biāo)記蛋白cleavedcaspase-3的水平。
　　結(jié)果:
　　1、PKCβ2在腸缺血再灌注損傷中的特異性激活
　　缺血再灌注后PKCβ2存在顯著地細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，而PKCβ1,PKCδ，andPKCε在細(xì)胞膜上的分布無(wú)明顯改變。缺血再灌注后PKCβ2在蘇氨酸T-641位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高，導(dǎo)致磷酸化PKCβ2/細(xì)胞總PKCβ2比例明顯增加。
　　2、魯伯斯塔對(duì)

6、腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　魯伯斯塔保護(hù)缺血再灌注后腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性,降低了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和病理評(píng)分;減輕腸缺血再灌注后炎癥茵子TNF-α和IL-6釋放入血。魯伯斯塔抑制腸缺血再灌注后PKCβ2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位及磷酸化活化;抑制腸缺血再灌注后p66Shc激活。
　　3、腸缺血再灌注/缺氧復(fù)氧中PKCβ2對(duì)p66Shc特異性調(diào)控
　　正常含氧量條件和缺氧復(fù)氧條件下siRNA-PKCβ2降低了PKCβ2的表達(dá)及PKCβ2

7、的磷酸化激活;正常含氧量條件下siRNA-PKCβ2對(duì)p66Shc的活化無(wú)影響，而在缺氧復(fù)氧條件下，siRNA-PKCβ2抑制p66Shc的過(guò)表達(dá)及磷酸化激活;PMA(PKC的激動(dòng)劑)明顯增加Caco-2細(xì)胞的磷酸化，這一過(guò)程被siRNA-PKCβ2和魯伯斯塔顯著抑制。
　　4、PKCβ2/p66Shc信號(hào)通路對(duì)腸缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　魯伯斯塔逆轉(zhuǎn)腸缺血再灌注誘導(dǎo)的MnSOD的下調(diào);抑制缺血再灌注后腸組織中活性氧簇

8、的累積;保護(hù)缺血再灌后GSH系統(tǒng)的耗竭和GSH-Px活性的降低。魯伯斯塔減少缺血再灌后腸粘膜凋亡細(xì)胞的數(shù)目;抑制缺血再灌注后細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白cleavedcaspase-3的水平。
　　結(jié)論:
　　1、PKCβ2在腸缺血再灌注后發(fā)生特異性激活;提示PKCβ2有可能是腸缺血再灌注損傷的重要調(diào)控靶點(diǎn)。
　　2、魯伯斯塔對(duì)腸缺血再灌注損傷起保護(hù)作用;這種保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制PKCβ2的活化，進(jìn)而抑制p66Shc的激活實(shí)現(xiàn)的