P66Shc介導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)變化在糖尿病腎病腎小管氧化損傷中的研究.pdf

1、研究背景:糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是慢性腎臟病中最常見(jiàn)的繼發(fā)性病因，也是引起終末期腎臟疾病(ESRD)的主要原因之一。腎小管細(xì)胞的氧化損傷和凋亡是DN早期的主要臨床特征之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近期研究證明:線粒體形態(tài)功能異常引起的線粒體動(dòng)力學(xué)變化和線粒體ROS的過(guò)量產(chǎn)生在其中可能起著關(guān)鍵作用，且兩者關(guān)系密切。銜接蛋白p66Shc是誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，以及調(diào)節(jié)生命周期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要分子。在

2、高葡萄糖刺激下，p66Shc被激活并轉(zhuǎn)位至線粒體，引起線粒體ROS過(guò)量產(chǎn)生并介導(dǎo)腎小管細(xì)胞的氧化損傷和凋亡。但在糖尿病環(huán)境中:DN患者的腎小管細(xì)胞是否發(fā)生線粒體動(dòng)力學(xué)變化仍缺乏證據(jù);線粒體片段化和線粒體ROS過(guò)度產(chǎn)生的因果關(guān)系尚不明確，以及p66Shc是否通過(guò)介導(dǎo)線粒體動(dòng)力學(xué)變化這一新途徑引起DN腎小管細(xì)胞氧化損傷和凋亡仍有待闡明。因此，本課題將圍繞這三個(gè)具體問(wèn)題展開(kāi)研究。
　　 目的:觀察DN患者腎組織中小管細(xì)胞的線粒體動(dòng)力學(xué)

3、變化和氧化損傷，及p66Shc和線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而尋找DN腎小管損傷的病因和機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究在高葡萄糖刺激下線粒體片段化的分子機(jī)制及其和線粒體ROS過(guò)度產(chǎn)生的因果關(guān)系;并探討p66Shc是否作為兩者聯(lián)系的樞紐，通過(guò)介導(dǎo)線粒體片段化進(jìn)而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、選取DN和對(duì)照組微小病變患者各10例，常規(guī)HE、PAS和PASM染色觀察兩組腎活檢組織中腎小球和腎

4、小管的病理改變，應(yīng)用電鏡觀察腎小管細(xì)胞線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，DHE染色檢測(cè)腎組織中ROS水平，并通過(guò)免疫組化及免疫熒光方法檢測(cè)兩組腎組織中p66Shc蛋白，線粒體分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn1的表達(dá)情況。
　　 2、體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，經(jīng)MitoRed染色在共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度和時(shí)間葡萄糖刺激下的線粒體動(dòng)力學(xué)變化，并行WesternBlot檢測(cè)Drp1和Mfn1的相應(yīng)蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用mdivi-1抑制

5、Drp1表達(dá)，免疫熒光顯微鏡檢測(cè)低糖和高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞Drp1表達(dá)、線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體ROS產(chǎn)生的變化。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染p66Shc野生型或siRNA質(zhì)粒，分析其對(duì)Drp1表達(dá)、線粒體動(dòng)力學(xué)和ROS產(chǎn)生的影響和機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1、患者腎活檢組織常規(guī)病理染色顯示:與對(duì)照組微小病變患者比較，DN患者腎組織有明顯結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化，腎小管可見(jiàn)空泡變性和基底膜增厚，并有明顯小管硬化和萎縮。電鏡示DN患者腎

6、小球較之對(duì)照組，基底膜增厚以及腎小管細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著片段化改變(P＜0.05);DHE染色顯示DN患者腎組織ROS水平明顯升高;免疫組化和免疫熒光檢測(cè)證實(shí):與對(duì)照組比較，p66Shc和Drp1蛋白表達(dá)明顯升高，而Mfn1的表達(dá)降低(P＜0.05）。
　　 2、在HK-2細(xì)胞中，線粒體形態(tài)在低糖環(huán)境下呈細(xì)絲狀，而在高糖刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)槎贪艋蝾w粒狀，且隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)線粒體片段化的細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，同時(shí)調(diào)控線

7、粒體動(dòng)力學(xué)的分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn1在高糖刺激下的表達(dá)變化呈時(shí)間和劑量依賴性。用Drp1抑制劑mdivi-1干預(yù)后，高糖+mdivi-1組比高糖組細(xì)胞的Drp1表達(dá)下降，發(fā)生線粒體片段化的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平均明顯降低(P＜0.05)。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染p66Shc質(zhì)粒后顯示:與低糖組比較，低糖+野生型p66Shc質(zhì)粒組的細(xì)胞內(nèi)Drp1表達(dá)升高，線粒體片段化增多，且線粒體ROS水平升高，而加入mdivi-1干預(yù)后，上述變化

8、均有減弱;在高糖環(huán)境下，高糖+p66ShcsiRNA組較之高糖+空質(zhì)粒組，Drp1表達(dá)降低，線粒體片段化程度減輕，且線粒體ROS水平下降。這些提示p66Shc可通過(guò)影響Drp1的活性來(lái)介導(dǎo)線粒體動(dòng)力學(xué)變化，進(jìn)而引起線粒體ROS過(guò)量產(chǎn)生。
　　 結(jié)論:
　　 該研究首次在DN患者腎活檢組織中證實(shí)了腎小管細(xì)胞發(fā)生線粒體片段化，伴隨著線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控蛋白的表達(dá)變化和細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)量產(chǎn)生。并闡明了p66Shc可能通過(guò)影響Drp