烏頭湯配伍減毒及對(duì)Ra-HFLS PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。文獻(xiàn)記載，烏頭湯用于痹證的治療療效確切。烏頭湯記載在《金匱要略》，是東漢時(shí)代著名醫(yī)學(xué)家張仲景創(chuàng)制的一首名方，由川烏、麻黃、芍藥、黃芪、炙甘草五味藥材組成，具有溫經(jīng)祛寒，除濕止痛的功效，主治寒濕痹證。著名老中醫(yī)李可先生在原方基礎(chǔ)上加上黑豆及防風(fēng)，創(chuàng)改良方，以達(dá)到制約制川烏毒性的目的，同時(shí)保持原方的藥效。

2、
　　本研究是在課題組前期已開(kāi)展的配伍減毒實(shí)驗(yàn)、譜效學(xué)研究和烏頭湯生物堿對(duì)人類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(RA-HFLS)增殖影響研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)烏頭湯的配伍減毒、以及烏頭湯生物堿抑制人類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(HFLS)增殖的機(jī)制進(jìn)行探究，為烏頭湯的臨床用藥以及進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1、烏頭湯配伍減毒研究
　　采用HPLS-ESI-MS技術(shù)分析生川烏單煎液、制川烏單煎液、金匱烏頭湯、李可改良之烏

3、頭湯中烏頭堿型生物堿類(lèi)成分，比較炮制以及配伍對(duì)烏頭堿型生物堿成分的影響，同時(shí)，利用UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定生川烏單煎液、制川烏單煎液、金匱烏頭湯、李可改良之烏頭湯中6種烏頭堿的含量，總結(jié)川烏減毒的規(guī)律。
　　2、烏頭湯中麻黃總生物堿對(duì)TNF-α誘導(dǎo)RA-HFLS PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用
　　利用體外培養(yǎng)HFLS，TNF-α誘導(dǎo)HFLS增殖模擬RA體內(nèi)環(huán)境，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)，比較烏頭湯不同生物堿

4、部位對(duì)HFLS的增殖抑制作用。設(shè)計(jì)3個(gè)給藥組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):烏頭湯總生物堿組、制川烏總生物堿組、麻黃總生物堿組，并對(duì)各組細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　分析結(jié)果顯示，麻黃總生物堿對(duì)RA-HFLS增殖抑制作用效果最佳，因此，以麻黃總生物堿為研究對(duì)象，進(jìn)一步探究麻黃總生物堿抑制RA-HFLS增殖的作用機(jī)制。通過(guò)ELISA法測(cè)定TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLS細(xì)胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)，觀察麻黃總生物堿對(duì)RA-HFLS中TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

5、。同時(shí)利用Western Blot方法檢測(cè)不同濃度麻黃總生物堿對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的RA-HFLS中非磷酸化及磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　在烏頭湯配伍減毒研究部分，對(duì)比生川烏單煎液和制川烏單煎液中烏頭堿型生物堿成分以及6種烏頭堿的含量發(fā)現(xiàn)，藥材中所含的毒性較強(qiáng)雙酯型烏頭堿經(jīng)炮制后，水解成毒性較弱的單酯型烏頭堿，從而達(dá)到減毒的炮制效果;通過(guò)與制川烏單煎液對(duì)比，發(fā)現(xiàn)金匱烏頭湯和李可改良之烏頭湯配伍后，

6、已基本上不存在雙酯型烏頭堿水解減毒的作用，主要是單酯型烏頭堿的成分損失起到減毒的作用，而且李可改良之烏頭湯的配伍減毒效果要優(yōu)于金匱烏頭湯。
　　在烏頭湯中麻黃總生物堿對(duì)TNF-α誘導(dǎo)RA-HFLS PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用研究部分，體外細(xì)胞藥效篩選研究表明麻黃總生物堿對(duì)RA-HFLS增殖的抑制作用強(qiáng)于烏頭湯總生物堿和制川烏總生物堿。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示麻黃總生物堿能降低RA-HFLS中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平，并

7、呈劑量依賴性。Western Blot方法分析顯示不同劑量的麻黃總生物堿均能下調(diào)RA-HFLS磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性，但對(duì)RA-HFLS中非磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達(dá)則無(wú)抑制作用。
　　結(jié)論：
　　烏頭湯在炮制過(guò)程中雙酯型烏頭堿水解成單酯型烏頭堿的基礎(chǔ)上，通過(guò)配伍來(lái)進(jìn)一步減少單酯型烏頭生物堿的成分，從而起到減毒的效果，同時(shí)在配伍過(guò)程中雙酯型烏頭堿水解減毒發(fā)揮的作用非常微弱。
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