昆母提取物對Ra-HFLS增殖及MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:
　　觀察昆明山海棠配伍益母草（昆母）不同提取物對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-HFLS)增殖的抑制作用，了解其對RA-HFLS的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA表達(dá)水平的影響，從cyclin D1、bcl-2、bax及caspase-3基因水平探討其作用于細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的可能機制。同時觀察昆母對絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路蛋白磷酸化的影響，探討其可能的作用機制。
　　

2、方法:
　　利用3-5代RA-HFLS為研究對象，分別給予昆母乙酸乙酯提取物、昆母氯仿提取物、昆母石油醚提取物及昆母正丁醇提取物處理24h、48h及72h，以CCK-8檢測各提取物對RA-HFLS的生長抑制率，流式細(xì)胞儀檢測24h各組的細(xì)胞周期及凋亡率;昆母乙酸乙酯提取物及氯仿提取物處理24h，利用qPCR檢測Cyclin D1、VEGF、bcl-2、bax及caspase-3表達(dá)水平，應(yīng)用western bolt檢測各組ERK、

3、pERK、JNK、pJNK、P38及pP38蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.昆母各提取物對RA-HFLS增殖的抑制作用
　　(1)昆母乙酸乙酯提取物:與零加藥組比較，高劑量組能抑制24h的細(xì)胞增殖（P＜0.05)，而MTX組及所有提取物組均可抑制48h及72h的增殖（均P＜0.01）。低劑量組48h的細(xì)胞增殖與MTX組相當(dāng)（P＞0.05），而中、高劑量組則比MTX組更強（均P＜0.01）。與MTX組比較，低劑量組72h

4、的抑制作用偏弱，而中、高劑量組則更強(均P＜0.01)。
　　(2)昆母氯仿提取物:與零加藥組比較，24h各組均不能抑制RA-HFLS增殖，而高劑量組抑制率稍高（P＞0.05）;48h及72h各組均能顯著抑制細(xì)胞增殖（均P＜0.01）。與MTX組比較，低劑量組48h的抑制作用相當(dāng)(P＞0.05)，72h偏弱（P＜0.01），而中高劑量組48h及72h的抑制作用則更強（均P＜0.01）。
　　(3)昆母石油醚提取物:與零加藥組

5、比較，24h各組均不能抑制RA-HFLS增殖，而高劑量組抑制率稍高(P＞0.05);48h及72h各組均能顯著抑制細(xì)胞增殖（均P＜0.01）。與MTX組比較，低劑量組48h的抑制作用相當(dāng)(P＞0.05)，72h偏弱（P＜0.01），而中高劑量組48h及72h的抑制作用則更強（均P＜0.01)。
　　(4)昆母正丁醇提取物:與零加藥組比較，24h各組均不能抑制RA-HFLS增殖，而高劑量組抑制率稍高(P＞0.05);48h及72h各

6、組均能顯著抑制細(xì)胞增殖（均P＜0.01)。與MTX組比較，低劑量組48h的抑制作用相當(dāng)(P＞0.05)，低劑量組72h的抑制作用偏低（P＜0.05），而中高劑量組48h及72h的抑制作用則更強（均P＜0.01）。
　　(5)相同濃度的昆母各提取物對RA-HFLS的抑制作用，時間越長，抑制作用越強，抑制率越高;相同作用時間點，藥物濃度越高，對成纖維樣滑膜細(xì)胞的抑制作用越強，抑制率越高。昆母各提取物對成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的抑制作用，呈

7、時間和劑量依賴性。
　　2.昆母提取物對RA-HFLS細(xì)胞周期的影響
　　干預(yù)24h，每組均與空白組比較G1期及PI。昆母氯仿、乙酸乙酯及石油醚提取物低劑量組G1期及PI均無變化（均P＞0.05）。中高劑量組G1期明顯升高，PI明顯降低（均P＜0.01）。昆母正丁醇提取物低、中、高劑量組G1期明顯升高，PI明顯降低（均P＜0.01）。
　　3.昆母提取物對RA-HFLS凋亡的影響
　　干預(yù)24h后，每組均與空白組

8、比較。MTX組凋亡率明顯升高（P＜0.01);氯仿及石油醚提取物低劑量組凋亡率無變化（均P＞0.05）;乙酸乙酯及正丁醇提取物低劑量組凋亡率升高（分別P＜0.05、P＜0.01）;各提取物中、高劑量組凋亡率均明顯升高(均P＜0.01)。
　　每組均與MTX組比較。所有提取物低劑量組凋亡率均偏低（均P＜0.01）;氯仿、乙酸乙酯及正丁醇提取物中劑量組相當(dāng)(均P＞0.05）;石油醚提取物中劑量組凋亡率偏低（P＜0.01））。昆母各提取

9、物高劑量組凋亡率均偏高（均P＜0.01）。
　　4.昆母提取物對RA-HFLS血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細(xì)胞周期蛋白D1、Bax、bcl-2及caspase-3的影響
　　(1)氯仿及乙酸乙酯提取物對VEGF表達(dá)的影響
　　qPCR顯示，與未加TNF-α組比較，TNF-α組VEGF表達(dá)升高(P＜0.05)。與TNF-α組比較，MTX組（P＜0.05)、乙酸乙酯提取物高劑量組及所有氯仿提取物組（均P＜0.01）表達(dá)下

10、降，乙酸乙酯提取物低劑量及中劑量組無變化（均P＞0.05）。與MTX組比較，乙酸乙酯提取物低劑量組VEGF表達(dá)稍高（P＜0.05)，乙酸乙酯提取物中劑量組及氯仿提取物低劑量組當(dāng)(均P＞0.05），乙酸乙酯提取物高劑量組及氯仿提取物中、高劑量組偏高（均P＜0.01）。
　　(2)氯仿及乙酸乙酯提取物對cyclin D1表達(dá)的影響
　　qPCR顯示，與未加TNF-α組比較，TNF-α組cyclin D1水平明顯升高（P＜0.01

11、)，與TNF-α組比較，MTX組、乙酸乙酯各組及氯仿中、高劑量組cyclin D1明顯降低（均P＜0.01），昆母氯仿低劑量組cyclin D1水平變化不明顯（P＞0.05）。與MTX組比較，乙酸乙酯（P＜0.05）及氯仿（P＜0.01)低劑量組cyclin D1水平偏高，乙酸乙酯中劑量組及氯仿中、高劑量組cyclin D1相當(dāng)（均P＞0.05），而乙酸乙酯高劑量組cyclinD1水平則顯著降低(P＜0.01)。
　　(3)氯仿及

12、乙酸乙酯提取物對bcl-2表達(dá)的影響
　　qPCR顯示，與未加TNF-α組比較，TNF-α組bcl-2水平明顯升高（P＜0.01）。與TNF-α組比較，MTX組、乙酸乙酯及氯仿中、高劑量組bcl-2水平明顯降低（P＜0.01)，昆母氯仿低、中劑量組無變化（均P＞0.05）。與MTX組比較，昆母乙酸乙酯及氯仿低劑量組bcl-2水平偏高（均P＜0.01），乙酸乙酯及氯仿中劑量組bcl-2變化不明顯（均P＞0.05），乙酸乙酯（P＜0.

13、01）及氯仿（P＜0.05）高劑量組bcl-2水平則顯著降低。
　　(4)氯仿及乙酸乙酯提取物對bax表達(dá)的影響
　　qPCR顯示，與未加TNF-α組比較，TNF-Ⅱ組bax水平降低（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各組bax表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.01）。與MTX組比較，乙酸乙酯低劑量組bax表達(dá)相當(dāng)（P＞0.05），乙酸乙酯中、高劑量組及氯仿各組均明顯升高（均P＜0.01）。
　　(5)氯仿及乙酸乙酯提取物

14、對bcl-2/bax表達(dá)的影響
　　與未加TNF-α組比較，TNF-α組bcl-2/bax升高（P＜0.05）。與TNF-α組比較，各組bcl-2/bax均明顯降低（均P＜0.01）。與MTX組比較，乙酸乙酯低劑量組bcl-2/bax偏高（P＜0.05），乙酸乙酯中劑量組及氯仿低中劑量組變化不明顯（均P＞0.05），乙酸乙酯及氯仿高劑量組bcl-2/bax水平明顯降低（均P＜0.01）。
　　(6)氯仿及乙酸乙酯提取物對ca

15、spase-3表達(dá)的影響
　　qPCR顯示，與未加TNF-α組比較，TNF-α組caspase-3水平降低（P＜0.05）。與TNF-α組比較，MTX組caspase-3升高（P＜0.05）。乙酸乙酯及氯仿低劑量組無變化(均P＞0.05)，乙酸乙酯（均P＜0.01）及氯仿（P＜0.05、P＜0.01）中、高劑量組升高。與MTX組比較，乙酸乙酯中、高劑量組及氯仿低、中劑量組無差異（均P＞0.05），乙酸乙酯低劑量組caspase-3

16、偏低（P＜0.05）而氯仿高劑量組偏高（P＜0.05）。
　　5.昆母提取物對ERK、pERK、JNK、pJNK、P38及p-P38的影響
　　昆母乙酸乙酯及氯仿提取物干預(yù)24h。與未加TNF-α組比較，TNF-α組p-ERK與ERK比值稍升高(P＞0.05)。與TNF-α組比較，昆母乙酸乙酯低劑量組p-ERK與ERK比值變化不明顯(P＞0.05)，中、高劑量組p-ERK與ERK比值明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.0

17、1）;昆母氯仿低、高劑量組p-ERK與ERK比值變化不明顯(均P＞0.05)，中劑量組p-ERK與ERK比值明顯降低(P＜0.01)。
　　與未加TNF-α組比較，TNF-α組pJNK與JNK比率升高（P＜0.01）。與TNF-α組比較，昆母乙酸乙酯低劑量組及氯仿低、中劑量組比率下降（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05），昆母乙酸乙酯中、高劑量組及昆母氯仿高劑量組均偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.

18、05)
　　與未加TNF-α組比較，TNF-α組p-P38與P38比率升高(P＜0.05)。與TNF-α組比較，昆母乙酸乙酯及氯仿提取物各組p-P38與P38比率均明顯降低（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物均能抑制RA-HFLS增殖，且抑制呈時間和濃度依賴性，時間越長，抑制率越高;濃度越大，抑制率越高。同濃度條件下，昆母氯仿、乙酸乙酯與石油醚提取物對RA

19、-HFLS增殖的抑制作用比昆明正丁醇更強。
　　2.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物對RA-HFLS增殖的抑制可能是通過降低Cyclin D1表達(dá)，使細(xì)胞周期G1期及S期發(fā)生阻滯實現(xiàn)的。
　　3.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物可以呈濃度依賴性地使RA-HFLS發(fā)生凋亡，濃度越高，凋亡率越高。
　　4.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物促凋亡是由多種因素共同調(diào)節(jié)的，其機制可能是降低bcl-2表達(dá)，升