PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)鈣蛋白酶6表達(dá)及生物學(xué)功能的調(diào)控及其分子機(jī)制.pdf

1、鈣蛋白酶(calpalns，CAPNs)家族是一類鈣依賴的在各種生物學(xué)過程發(fā)揮作用的半胱氨酸蛋白酶，該家族根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)的不同分為兩類，即經(jīng)典型和非經(jīng)典型CAPNs。經(jīng)典型CAPNs包括CAPN1、2、3、8、9和11，蛋白結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)penta-EF手型結(jié)構(gòu)域，該類型表達(dá)廣泛，參與了細(xì)胞的各種活動(dòng)如轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控等。非經(jīng)典型CAPNs蛋白結(jié)構(gòu)中沒有penta-EF手型結(jié)構(gòu)域，包括CAPN5、6、7、10、12和14

2、，CAPN6是該家族的成員之一，位于X染色體。文獻(xiàn)曾報(bào)道CAPN6的表達(dá)有組織特異性，CAPN6mRNA在胚胎表達(dá)很高，而在出生后的CAPN6強(qiáng)烈下調(diào)，但發(fā)現(xiàn)CAPN6在子宮肉瘤和癌肉瘤(carcinosamoma)組織高表達(dá)。研究結(jié)果顯示CAPN6是一種微管穩(wěn)定蛋白，參與微管的動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞骨架的重組，也可通過抑制細(xì)胞的凋亡和有助予血管的形成而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。上述研究結(jié)果提示CAPN6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但總起來說研究甚少，

3、關(guān)于CAPN6的基因表達(dá)調(diào)控至今沒有報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室的基因芯片結(jié)果顯示在過表達(dá)Akt的小鼠成纖維細(xì)胞CAPN6mRNA顯著上調(diào)，推測(cè)CAPN6表達(dá)可能受PI3K-Akt調(diào)控，并對(duì)此進(jìn)行了深入研究。
　　本文第一部分研究PI3K-Akt對(duì)CAPN6蛋白及mRNA表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果證明PI3K-Akt能夠上調(diào)CAPN6蛋白及mRNA表達(dá)。應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002處理腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長(zhǎng)CAPN6蛋白逐漸下降。用IGF-1處

4、理HeLa細(xì)胞不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)Akt磷酸化水平逐漸升高，CAPN6蛋白也表達(dá)增加，說明IGF-1能激活A(yù)kt從而促進(jìn)CAPN6表達(dá)。用下調(diào)HeLa細(xì)胞PTEN表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化水平增加，CAPN6蛋白水平增加。在穩(wěn)定下調(diào)Akt的7404細(xì)胞CAPN6表達(dá)下降，用Akt抑制劑處理7404細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)CAPN6蛋白下調(diào)。應(yīng)用Real-timeRT-PCR方法證明LY294002處理腫瘤細(xì)胞后CAPN6mRNA水平下降，還證實(shí)CAP

5、N6mRNA在過表達(dá)Akt的MEF細(xì)胞比對(duì)照組的細(xì)胞CAPN6mRNA水平顯著增加，用LY294002處理后下降。在下調(diào)Akt1或Akt2的7404細(xì)胞中CAPN6mRNA顯著降低。本部分證明了PI3K-Akt能上調(diào)CAPN6表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通過GSK-3B調(diào)控CAPN6的表達(dá)。
　　為進(jìn)一步研究PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)內(nèi)源性CAPN6蛋白表達(dá)的分子機(jī)制。在第二部分，首先用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞，

6、后用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理細(xì)胞，用Western blot的方法檢測(cè)CAPN6蛋白水平發(fā)現(xiàn)LY294002能縮短內(nèi)源性CAPN6的半衰期，降低其穩(wěn)定性。為研究Akt在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中起的作用，穩(wěn)定下調(diào)Akt表達(dá)后的結(jié)果顯示Akt不影響CAPN6的穩(wěn)定性。用GSK-3β抑制劑LiCl或mTOR抑制劑Rapamyein與CHX處理細(xì)胞作用不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)LiCl能降低CAPN6半衰期。用LY294002、LiCl或Rapamycin與蛋白酶

7、體抑制劑MG132處理細(xì)胞后檢測(cè)CAPN6蛋白，發(fā)現(xiàn)LY294002與LiCl可促進(jìn)蛋白酶體介導(dǎo)的CAPN6降解，但Rapamycin不影響此過程。上述結(jié)果說明PI3K-Akt可能通過提高CAPN6蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和抑制蛋白酶體對(duì)其的降解而增加其表達(dá)。
　　為深入研究PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控CAPN6基因表達(dá)的分子機(jī)制，本文第三部分研究PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)CAPN6基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的調(diào)控。首先擴(kuò)增一系列長(zhǎng)度不同的CAPN6

8、啟動(dòng)子，將其克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-BaSic上游，經(jīng)測(cè)序比對(duì)正確后，選擇構(gòu)建成功載體進(jìn)行下一步研究。用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法及雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)研究啟動(dòng)子質(zhì)粒在7404、HeLa和293T細(xì)胞中的CAPN6啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)-93/+200bp片段的啟動(dòng)子活性最強(qiáng)。隨后觀察LY294002對(duì)該片段啟動(dòng)子活性影響，發(fā)現(xiàn)LY294002能夠降低CAPN6啟動(dòng)子活性；下調(diào)Akt1或Akt2能降低CAPN6基因啟動(dòng)子活性。上述結(jié)果說明：PI3K-

9、Akt能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)CAPN6基因的表達(dá)。為研究哪些可能的轉(zhuǎn)錄因子參與了CAPN6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析-93/+200bp片段的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從中選擇了一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)并將其進(jìn)行點(diǎn)突變，并構(gòu)建點(diǎn)突變的啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa和7404細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)將AP1、FoxD3、Oct-1和HNF-3β等結(jié)合位點(diǎn)突變后CAPN6基因活性下降。之后將-93/+200bp片段的啟動(dòng)子質(zhì)粒與AP1、FoxD3或Oc

10、t-1siRNA共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)將下調(diào)上述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)后啟動(dòng)子活性仍然下降，蛋白和mRNA水平都分別有不同程度下降，說明AP1、FoxD3和Oct-1都能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CAPN6的表達(dá)。應(yīng)用CHIP的方法進(jìn)一步證明了AP1、FoxD3和Oct-1能與CAPN6基因啟動(dòng)子結(jié)合。
　　本文第四部分研究CAPN6的一些細(xì)胞生物學(xué)功能。應(yīng)用細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)方法觀察CAPN6對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，將下調(diào)C