桂皮醛通過PI3K-AKT信號通路對于腸癌細胞生物學行為的影響及其作用機制.pdf

1、目的:
　　觀察桂皮醛對腸癌細胞增殖、侵襲與黏附、細胞凋亡的影響及與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系。
　　方法:
　?、費TT法檢測不同濃度桂皮醛(0，20，40，60，80μg/ml)作用于人腸癌細胞(Lovo、SW480、HCT116)12、24、48h后對細胞增殖能力的影響;
　　②根據(jù)第一部分實驗最終采用（0，20，40，80μg/ml的濃度及給藥后24小時觀察的方式進行第二部分實驗。使用基質(zhì)粘附實驗及T

2、ranswell小室實驗檢測桂皮醛對細胞侵襲及粘附能力的影響;Western blot法檢測檢測侵襲粘附相關(guān)蛋白(E-cadherin、MMP-2、MMP-9)的表達量。
　?、跦oechst33258熒光染色檢測桂皮醛對細胞凋亡形態(tài)學的影響;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率;Western blot法檢測細胞凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、PARP、cleaved-PARP)的表達量。
　?、苓M一步探討桂皮醛對于PI3K/Akt

3、通路的影響，使用40μg/ml的中等劑量處理三種細胞株24h后Western blot法檢測PI3K，p-PI3K，Akt及p-Akt的表達量。為明確桂皮醛對于該通路的阻斷效果及阻斷位點，使用10 ng/mL的IGF-I對細胞株預處理2h（激動該通路作為陰性參照組），LY294002+2 hIGF-I（LY294002阻斷作用及位點明確，作為陽性參照組）空白組及40μg/ml桂皮醛+2 hIGF-I（實驗組）。使用Western blo

4、t法檢測以上各組PI3K、Akt和p-Akt p-PI3K的表達量明確桂皮醛的阻斷效果及阻滯位點。
　?、萏接懝鹌とδc癌細胞凋亡的影響與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系，根據(jù)第四部分實驗，分為五個實驗組，采取不同的組合方式，用Western blot法檢測胞凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Bax、PARP、cleaved-PARP）的表達量表達的變化。
　　結(jié)果:
　　不同劑量的桂皮醛在對三種分化及侵襲能力不同的細胞給藥12

5、h、24、48小時后，根據(jù)MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂皮醛對這三種腸癌細胞有明顯抑制增殖的作用，這種抑制作用成濃度和時間依賴性;桂皮醛以不同濃度對三株腸癌細胞給藥24h后發(fā)現(xiàn)，與對照組相相比，其能顯著抑制腸癌細胞的侵襲能力，鏡下顯示侵襲過去的細胞數(shù)目均明顯低于對照組，且呈濃度依賴關(guān)系，基質(zhì)粘附實驗結(jié)果顯示，和MTT結(jié)果一致桂皮醛對腸癌細胞的粘附抑制作用呈時間和濃度依賴關(guān)系，對侵襲率的抑制亦呈濃度依賴關(guān)系，為進一步明確抑制粘附及侵襲機制，West

6、ern Bolt檢測了粘附侵襲相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示上皮粘蛋白(E-cadherin)E-cad的表達呈與濃度成正相關(guān)性，而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達則呈負相關(guān)性。Hoechst33258熒光染色檢測桂皮醛對細胞凋亡形態(tài)學的影響，觀察到在細胞核凋亡時出現(xiàn)的核固縮及碎裂，為了量化桂皮醛的凋亡率我們使用AnnexinⅤ/PI雙染實驗，結(jié)果顯示桂皮醛能誘導三種腸癌細胞的凋亡且與濃度呈正相關(guān)，Western Bolt實驗證明桂

7、皮醛能上調(diào)Bax、cleaved-PARP的表達，下調(diào)Bcl-2、PARP的活性，且這種表達呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。進一步實驗發(fā)現(xiàn)中等劑量的桂皮醛對于PI3K/Akt通路即有明顯的抑制作用，p-PI3K, p-Akt的表達量均減少，其中p-AKT/AKT的比值明顯降低。為明確桂皮醛對該通路的抑制作用及阻滯位點分別使用通路的激動劑及抑制劑做為陰性參照和陽性參照，實驗表明桂皮醛對該通路有明確的阻滯作用，即可阻滯PI3K的活化亦可阻滯Akt的活化，

8、其對Akt的阻斷作用較LY294002相似。探討桂皮醛對腸癌細胞凋亡的影響與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系，第五部分實驗表明IGF-1誘導的抗凋亡能明顯的被桂皮醛抑制，且作用與LY294002相似。綜上所述，桂皮醛可以下調(diào)PI3K/Akt依賴的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導細胞凋亡相關(guān)基因表達。
　　結(jié)論:
　　桂皮醛能有效抑制人腸癌細胞的增殖。桂皮醛對其侵襲轉(zhuǎn)移具有抑制作用，其機制可能與其上調(diào)E-cad蛋白的表達，下調(diào)MMP-2、MM