植入期二硫化碳暴露對(duì)小鼠子宮組織mTOR、整合素β3及LIF表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：
　　二硫化碳(Carbon disulfide，CS2)是工業(yè)上用途廣泛的有機(jī)溶劑，也是粘膠纖維、農(nóng)藥、橡膠、玻璃紙等的生產(chǎn)原料。生產(chǎn)過(guò)程中，CS2易揮發(fā)擴(kuò)散到生產(chǎn)環(huán)境中，對(duì)工人健康產(chǎn)生危害。我國(guó)是紡織品生產(chǎn)大國(guó)，粘膠纖維的產(chǎn)量呈高速增長(zhǎng)，并且該產(chǎn)業(yè)從業(yè)人數(shù)眾多，其中長(zhǎng)絲和短絲等紡絲工藝以女工接觸為主。
　　研究發(fā)現(xiàn)，CS2對(duì)心血管、神經(jīng)、肝臟、腎臟、內(nèi)分泌系統(tǒng)等均有毒性作用。另外，對(duì)CS2生殖毒性的研究發(fā)現(xiàn)，C

2、S2可導(dǎo)致男性工作者精子數(shù)量減少、畸形率增加、睪丸萎縮、性功能減退等，并可導(dǎo)致女工性腺機(jī)能障礙，流產(chǎn)和子代出生缺陷等。本課題組以CS2作業(yè)女工為觀察對(duì)象的前瞻性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS2作業(yè)女工受孕時(shí)間比對(duì)照人群明顯延長(zhǎng)，并且其早早孕丟失率明顯高于對(duì)照人群，提示CS2干擾胚胎著床。課題組采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植入期暴露于CS2致使小鼠的胚胎植入數(shù)目明顯減少，但其胚胎毒性的作用機(jī)制尚未闡明。近年來(lái)生殖過(guò)程中的調(diào)控通路研究成為關(guān)注方向，哺乳

3、動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)中處于核心地位，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞自噬等多種生物活動(dòng);且有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在胚胎植入過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，外源性化學(xué)物可通過(guò)mTOR通路干擾胚胎正常植入。此外，整合素β3及白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)可作為mTOR通路的上游調(diào)控因子

4、，參與調(diào)節(jié)mTOR的表達(dá)。因此，本研究假設(shè)植入期暴露于CS2后可通過(guò)mTOR及其上游調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)可導(dǎo)致胚胎植入障礙。
　　本研究擬采用小鼠動(dòng)物模型，在胚胎植入時(shí)期的不同時(shí)段暴露于CS2，于暴露后不同時(shí)間終止實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)孕鼠子宮組織mTOR、整合素β3以及LIF的表達(dá)水平，探討mTOR及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白在CS2致胚胎植入障礙中的毒性作用機(jī)制。
　　研究目的：
　　構(gòu)建胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2致小鼠胚胎植入障礙的動(dòng)

5、物模型，觀察不同時(shí)點(diǎn)CS2暴露對(duì)孕鼠母體及胚胎的毒作用，檢測(cè)不同暴露時(shí)間不同觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織中mTOR、整合素β3以及LIF的表達(dá)水平，探討mTOR及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白（整合素β3以及LIF）在CS2所致胚胎植入障礙中的作用，進(jìn)一步揭示CS2暴露致胚胎植入障礙機(jī)制，為預(yù)防和控制CS2作業(yè)女工生殖損傷提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分:第一部分建立暴露于CS2后的胚胎植入障礙時(shí)間依賴動(dòng)物

6、模型，觀察植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2后的母體毒性和胚胎毒性，并且觀察胚胎植入障礙的敏感暴露時(shí)點(diǎn)。第二部分，孕鼠在植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2并且在不同時(shí)點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)，收集孕鼠子宮組織檢測(cè)其中mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)水平，分析并探討mTOR在CS2致胚胎植入障礙中的作用機(jī)制。第三部分的動(dòng)物處理及分組同第二部分，檢測(cè)孕鼠子宮組織中整合素β3以及LIF蛋白及mRNA表達(dá)水平，并探討mTOR、整合素β3以及LIF三者的關(guān)系在CS2致胚胎植入

7、障礙中的作用機(jī)制。
　　2.染毒時(shí)間及方式
　　本實(shí)驗(yàn)第一、二、三部分動(dòng)物的染毒時(shí)間點(diǎn)相同，設(shè)4個(gè)染毒時(shí)間點(diǎn)，分別于胚胎植入期第3天(3th gestational day，GD3)、第4天(GD4)、第5天(GD5)和第6天(GD6)。實(shí)驗(yàn)期間每組孕鼠僅給予一次染毒，各組孕鼠于染毒時(shí)間點(diǎn)接受腹腔注射一次CS2或者溶劑（CS2暴露劑量為631.4 mg/kg;溶劑對(duì)照為橄欖油;注射容量為0.1ml/10g體重）。
　　

8、3.實(shí)驗(yàn)分組及觀察終點(diǎn)
　　實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)4個(gè)染毒時(shí)間分為定義1組至4組，即1組為GD3染毒、2組GD4染毒、3組GD5染毒、4組GD6染毒。
　　觀察終點(diǎn):第一部分四組的觀察終點(diǎn)均為GD9，用于觀察母體毒性及胚胎毒性，記錄胚胎植入數(shù)目。第二、三部分四組的觀察終點(diǎn)分別為:1組（GD3染毒）為GD4、GD5、GD6、GD7;2組（GD4染毒）為GD5、GD6、GD7，3組（GD5染毒）為GD6、GD7;4組（GD6染毒）為GD

9、7，每一部分均包括10個(gè)觀察終點(diǎn)，用于樣本收集以檢測(cè)子宮組織mTOR、整合素β3以及LIF蛋白及mRNA的表達(dá)水平。
　　3.動(dòng)物受孕及分組
　　SPF級(jí)性成熟昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按照雌雄比1∶1合籠，次日晨8點(diǎn)檢查陰栓，陰栓陽(yáng)性記為孕1天（即GD1），并將其隨機(jī)分到各個(gè)觀察終點(diǎn)。每個(gè)觀察終點(diǎn)含12只孕鼠，隨機(jī)分配6只接受CS2暴露，另6只為溶劑對(duì)照。
　　4.樣本收集及子宮組織mTOR、整合素β3以及LIF表達(dá)

10、水平的測(cè)定
　　第一部分中，四組孕鼠在GD9觀察終點(diǎn)經(jīng)脫臼處死，稱取子宮、卵巢、肝、脾、腎、胚胎的重量，并記錄胚胎植入的數(shù)目;第二、三部分，收集四組10個(gè)觀察終點(diǎn)的孕鼠子宮組織，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫渲幸话虢M織進(jìn)行勻漿后取上清液用于蛋白測(cè)定，另一半組織用于mRNA測(cè)定。
　　運(yùn)用免疫組織化學(xué)（Immunohistochmeistry，IHC）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzymes linked immunosorbent

11、assay，ELISA)測(cè)定孕鼠子宮組織中mTOR蛋白含量;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)定孕鼠子宮組織中mTOR的mRNA含量。運(yùn)用BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定孕鼠子宮組織勻漿液蛋白濃度;運(yùn)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法（western blotting）法測(cè)定孕鼠子宮組織中整合素β3以及LIF蛋白表達(dá)含量;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)定孕鼠子宮組織中整合素β3以及LIF的mRNA含量。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分

12、析
　　采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布的測(cè)量指標(biāo)均以(x)±s表示。各組指標(biāo)首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)進(jìn)行F檢驗(yàn)，差異有顯著性時(shí)采用Dunnett-t test比較各暴露組與對(duì)照組均數(shù)之間的差異;若方差不齊，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Kruskal-Wallis H法進(jìn)行組間比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05。
　　研究結(jié)果：
　　

13、1.圍植入期CS2暴露致孕鼠母體毒性及胚胎毒性
　　母體毒性:①在胚胎植入期的不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，暴露組GD9的孕鼠體重和凈體重增量與對(duì)照組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②暴露組GD9孕鼠的子宮、卵巢、肝臟、脾臟以及腎臟的臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　胚胎毒性:①在胚胎植入期的不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，GD3、GD4、GD5和GD6暴露組的胚胎植入數(shù)均低于對(duì)照組(P＜0.05)

14、，其中GD4暴露組的胚胎植入數(shù)目減少最為明顯。各暴露組的胚胎植入數(shù)較對(duì)照組分別減少了36.89％、57.58％、33.79％和36.55％。②各暴露組的胚胎窩重與對(duì)照比相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但校正胚胎植入數(shù)之后的胚胎均重與對(duì)照比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.圍植入期CS2暴露對(duì)孕鼠子宮組織mTOR蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響
　　胚胎植入期不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，GD3暴露組的GD4、

15、GD5和GD6觀察終點(diǎn)，GD4暴露組的GD5、GD6和GD7觀察終點(diǎn)，GD5暴露組的GD6和GD7觀察終點(diǎn)，孕鼠子宮組織mTOR蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有降低。其中，GD3暴露組的GD5觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織mTOR較對(duì)照組下降了37.32％(P＜0.01);GD4暴露組的GD5觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織mTOR蛋白下降最為明顯，較對(duì)照組下降了56.42％(P＜0.01); GD7觀察終點(diǎn)較對(duì)照組下降了45.22％(P＜0.01)。
　　m

16、RNA結(jié)果顯示，胚胎植入期不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，GD3暴露組的GD4、GD5、GD6和GD7觀察終點(diǎn)，GD4暴露組的GD5和GD6觀察終點(diǎn)，GD5暴露組的GD6觀察終點(diǎn)，孕鼠子宮組織mTOR的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均有降低。其中，GD3暴露組的GD5觀察終點(diǎn)孕鼠子宮組織mTOR的mRNA水平較對(duì)照組下降了62％(P＜0.01);GD4暴露組的GD5終點(diǎn)孕鼠子宮組織mTOR的mRNA水平較對(duì)照組下降了55％(P＜0.01)。
　

17、　3.圍植入期CS2暴露對(duì)孕鼠子宮組織整合素β3和LIF的蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響
　　在胚胎植入期的不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，各個(gè)暴露組孕鼠子宮組織整合素β3和LIF蛋白水平較對(duì)照組均有降低。GD3暴露組的GD4、GD5、GD7觀察終點(diǎn)整合素β3的蛋白較對(duì)照組下降了44％、43％、30％（P＜0.05）;GD4暴露組的GD5、GD7觀察終點(diǎn)整合素β3分別較對(duì)照組下降了29％、35％(P＜0.05); GD5暴露組的GD7觀察終

18、點(diǎn)整合素β3較對(duì)照組下降了36％（P＜0.01）;GD6暴露組的GD7觀察終點(diǎn)整合素β3較對(duì)照組下降了27％（P＜0.05）。GD3暴露組的GD4、GD5、GD6觀察終點(diǎn)LIF的蛋白較對(duì)照組下降了43.8％、48.7％、24.2％(P＜0.05); GD4暴露組的GD5觀察終點(diǎn)LIF較對(duì)照組下降了54.3％（P＜0.05）;GD5暴露組的GD6觀察終點(diǎn)LIF較對(duì)照組下降了38.7％(P＜0.05);GD6暴露組的GD7觀察終點(diǎn)LIF較對(duì)

19、照組下降了22.6％（P＜0.05）。
　　mRNA結(jié)果顯示，胚胎植入期的不同時(shí)點(diǎn)暴露于CS2后，各個(gè)暴露組孕鼠子宮組織整合素β3和LIF mRNA水平均有所降低。GD3暴露組的GD4、GD5、GD7觀察終點(diǎn)整合素β3的mRNA較對(duì)照組下降了72％、70％、80％(P＜0.01); GD4暴露組的GD5、GD7觀察終點(diǎn)整合素β3分別較對(duì)照組下降了88％、71％(P＜0.01);GD5暴露組的GD7觀察終點(diǎn)整合素β3較對(duì)照組下降了7

20、6％（P＜0.05）;GD6暴露組的GD7觀察終點(diǎn)整合素β3較對(duì)照組下降了47％（P＜0.05）。GD3暴露組的GD4、GD5、GD6觀察終點(diǎn)LIF的mRNA較對(duì)照組下降了45.8％、30.8％、28.4％(P＜0.05); GD4暴露組的GD5、GD6觀察終點(diǎn)整合素β3分別較對(duì)照組下降了45.9％、50％（P＜0.01）;GD5暴露組的GD6觀察終點(diǎn)整合素β3較對(duì)照組下降了25.8％（P＜0.05）;GD6暴露組的GD7觀察終點(diǎn)整合素

21、β3較對(duì)照組下降了20.1％（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.圍植入期暴露于CS2未顯示明顯的母體毒性，但可導(dǎo)致明顯的胚胎毒性，即胚胎數(shù)目的減少，并且在GD4暴露時(shí)胚胎丟失最為明顯。提示GD4暴露是CS2致胚胎植入障礙的敏感時(shí)間點(diǎn)。
　　2.圍植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮組織mTOR蛋白及mRNA表達(dá)水平下降，并且在GD4暴露后的第一個(gè)觀察終點(diǎn)最為明顯，提示mTOR表達(dá)水平的降低可能是CS2致胚胎植入障礙的機(jī)