二硫化碳干擾巨噬細(xì)胞的極化和功能在胚胎植入障礙中的作用.pdf

1、研究背景
　　二硫化碳(Carbondisulfide，CS2)是一種常用的粘膠纖維工業(yè)合成品原料，普遍應(yīng)用于服裝行業(yè)。服裝行業(yè)是一種以女性工作人員占主導(dǎo)的勞動(dòng)密集型產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，CS2對(duì)女性生殖系統(tǒng)的影響引起普遍關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，CS2職業(yè)暴露的女性較非職業(yè)人群生殖系統(tǒng)方面會(huì)受到不同程度的損害。本課題組前期對(duì)職業(yè)女工的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，同對(duì)照組女性人群相比，CS2暴露的職業(yè)女工人群表現(xiàn)出高的早早孕丟失以及受孕時(shí)間明

2、顯延遲等特點(diǎn)。同時(shí)，小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CS2生殖毒性作用最為敏感的時(shí)期是胚胎植入期。由此可見(jiàn)，CS2具有明顯的生殖毒性，并會(huì)影響胚胎植入，但其機(jī)制尚不清晰。
　　母胎界面的免疫微環(huán)境保證了容受性子宮內(nèi)環(huán)境的建立，進(jìn)而利于植入和妊娠。巨噬細(xì)胞在母胎界面微環(huán)境的建立中起著至關(guān)重要的作用。在胚胎植入期，母胎界面巨噬細(xì)胞積聚于此，清除凋亡細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)免疫耐受;同時(shí)，分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)母胎界面血管的形成與重塑，構(gòu)建胚胎發(fā)

3、育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶ケP血管。此外，巨噬細(xì)胞參與卵巢黃體的形成，以保證正常雌、孕激素的分泌與運(yùn)輸。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，圍植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮組織細(xì)胞炎性因子增多以及血清雌、孕激素水平下降，提示巨噬細(xì)胞與CS2致小鼠胚胎植入障礙過(guò)程密切相關(guān)。
　　綜上所述，植入期小鼠子宮和卵巢巨噬細(xì)胞極化和功能在CS2暴露后發(fā)生改變可能是其胚胎植入障礙的重要機(jī)制之一。因此，本研究利用已經(jīng)構(gòu)建的小鼠胚胎植入障礙模型，在胚胎植入期不同時(shí)點(diǎn)

4、暴露于二硫化碳后的不同時(shí)間斷面上，觀察小鼠卵巢和子宮組織中巨噬細(xì)胞極化和功能變化，以期揭示巨噬細(xì)胞極化和功能變化在二硫化碳致胚胎植入障礙中的作用。
　　研究目的
　　于小鼠受孕后植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2建立小鼠胚胎植入障礙模型，檢測(cè)不同暴露點(diǎn)后不同觀察終點(diǎn)子宮組織中巨噬細(xì)胞極化變化，并測(cè)定相關(guān)因子IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa的表達(dá);同時(shí)，檢測(cè)卵巢組織中巨噬細(xì)胞極化變化，并測(cè)定相關(guān)因子TNF

5、-α、Cox2、Hif1-α和Vegfa的表達(dá)，以期闡明巨噬細(xì)胞極化與功能改變?cè)贑S2致小鼠胚胎植入障礙中的作用和機(jī)制。
　　研究方法
　　1.動(dòng)物模型的建立
　　性成熟昆明種小鼠(8-12w)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行合籠，雌雄合籠比例為1∶1。次日早晨8點(diǎn)檢查雌性小鼠陰栓，以陰栓陽(yáng)性者定義為懷孕第一天(GD1)，并隨機(jī)分配到各組。模型共設(shè)3個(gè)染毒組（染毒時(shí)間點(diǎn)為GD3、GD4和GD5），并在各染毒時(shí)間點(diǎn)后的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置

6、觀察終點(diǎn)（GD4、GD5、GD6和GD7，共計(jì)13個(gè)觀察終點(diǎn)），每個(gè)觀察終點(diǎn)含有12只孕鼠。染毒組以631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量溶于橄欖油后進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組腹腔注射等體積的橄欖油作為溶劑對(duì)照。
　　2.樣本收集與巨噬細(xì)胞極化與功能的檢測(cè)
　　于各個(gè)觀察終點(diǎn)收集孕鼠子宮組織和卵巢組織。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織巨噬細(xì)胞極化情況（F4/80:巨噬細(xì)胞;CD16/32:M1型巨噬細(xì)胞;CD206:M2型巨噬

7、細(xì)胞）。應(yīng)用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定全子宮組織中IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa蛋白和mRNA的表達(dá)水平。制備卵巢組織石蠟切片，HE染色后對(duì)卵巢中的黃體進(jìn)行病理分析，并對(duì)病理評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分定量分析;同時(shí)采用免疫組化染色方法測(cè)定iNOS和Arg-1表達(dá)水平以檢測(cè)卵巢黃體M1、M2巨噬細(xì)胞含量并進(jìn)行定量分析。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定卵巢黃體中TNF-α、Cox2、Hif1-α以及VegfamR

8、NA的表達(dá)水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入，并應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并以P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將原始實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)除以對(duì)照組數(shù)據(jù)，使原始數(shù)據(jù)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。測(cè)量指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組比較之前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用DunnettTtest;若方差不齊，則選用Welch檢驗(yàn)

9、，兩兩比較采用Dunnett'sT3test。此外，應(yīng)用GraphPadPrism軟件繪制結(jié)果圖。
　　研究結(jié)果
　　1.CS2暴露對(duì)卵巢黃體結(jié)構(gòu)與功能的影響
　　圍植入期暴露于CS2后，相比于對(duì)照組，孕鼠卵巢黃體結(jié)構(gòu)和功能受到不同程度的損傷。在GD4染毒GD5觀察終點(diǎn)上，孕鼠卵巢黃體血管明顯擴(kuò)張與充血(P＜0.05)，卵巢結(jié)構(gòu)明顯受損(P＜0.05)。同時(shí)，Cox2和Hif1-αmRNA測(cè)定結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞因子均呈

10、現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中Cox2細(xì)胞因子的mRNA在GD3染毒GD5觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而在GD5染毒GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);Hif1-α細(xì)胞因子的mRNA在GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)、GD4染毒GD5觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，然后降至正常水平。提示，CS2暴露可導(dǎo)致孕鼠黃體損傷。
　　2.CS2暴露對(duì)卵巢黃體巨噬細(xì)胞極化平衡的影響
　　相比于對(duì)照組，圍植入期GD

11、3暴露組GD5觀察終點(diǎn)M1和M2巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(M1:P＜0.05;M2:P＜0.01)，隨后，M1型巨噬細(xì)胞降低至正常水平而M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量在GD6觀察終點(diǎn)明顯增加(P＜0.01)。同時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞在GD7觀察終點(diǎn)（GD4和GD5染毒）明顯下降(P＜0.05)。在植入窗口期，M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡由M1型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)（M1＞M2在GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)，P＜0.01）轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)（M1＜M2在GD5

12、染毒GD6觀察終點(diǎn)，P＜0.01）。
　　3.CS2暴露對(duì)子宮內(nèi)膜組織巨噬細(xì)胞極化平衡的影響
　　圍植入期GD3，GD4和GD5暴露于CS2后，各觀察終點(diǎn)子宮內(nèi)膜M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組（在GD7觀察終點(diǎn)P＜0.01）;但M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量于GD4染毒GD6觀察終點(diǎn)明顯升高(P＜0.05)。在植入窗口期，M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡由M1型為主導(dǎo)（GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)，P＜0.05）轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型為主導(dǎo)（GD3染毒G

13、D5觀察終點(diǎn)，P＜0.01），隨后又轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型為主(GD3染毒GD6和GD7觀察終點(diǎn))。
　　4.CS2暴露對(duì)子宮與卵巢組織免疫因子表達(dá)水平的影響
　　圍植入期GD3暴露于CS2后GD4觀察終點(diǎn)，相比于對(duì)照組，子宮組織中IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);而IL-12蛋白表達(dá)水平明顯下降(GD5，P＜0.01;GD7，P＜0.05)。另一方面，耐受因子的分泌變化紊亂，IL-10蛋白的表達(dá)水平在GD3染

14、毒GD4觀察終點(diǎn)(P＜0.05)和GD4染毒GD7觀察終點(diǎn)（P＜0.01）明顯升高，但在GD5染毒GD6觀察終點(diǎn)上表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。TGF-β1蛋白表達(dá)水平在GD4和GD6觀察終點(diǎn)明顯升高(P＜0.05)，其mRNA表達(dá)水平在GD7觀察終點(diǎn)明顯下降(P＜0.01)。卵巢組織中，TNF-αmRNA的表達(dá)水平明顯升高（GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)，P＜0.01;GD4染毒GD7觀察終點(diǎn)，P＜0.01;GD5染毒GD6觀察終點(diǎn)，P

15、＜0.05）。
　　5.CS2暴露對(duì)子宮與卵巢組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平的影響
　　相比于對(duì)照組，圍植入期GD3染毒暴露于CS2后，子宮組織中VegfamRNA表達(dá)水平在GD4觀察終點(diǎn)明顯升高(P＜0.05)而在GD6觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05);Vegfa蛋白表達(dá)水平在GD5觀察終點(diǎn)明顯下降(P＜0.05)。卵巢組織中，VegfamRNA表達(dá)水平在GD4和GD7觀察終點(diǎn)上明顯升高(P＜0.01)。