胚胎植入期二硫化碳暴露致小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷與凋亡研究.pdf

1、研究背景：
　　 二硫化碳(Carbon disulfide,CS2)是工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑,也是生產(chǎn)人造纖維、玻璃紙等許多化學(xué)物質(zhì)的原材料。此外,在橡膠硫化、谷物熏蒸、浮選、石油精制、石蠟溶解以及油脂提取等工業(yè)生產(chǎn)過程中都有可能接觸CS2。由于我國是服裝生產(chǎn)大國,該行業(yè)屬于勞動(dòng)密集型行業(yè),從業(yè)人數(shù)眾多,特別在人造絲、人造毛等紡織企業(yè)中,女工占相當(dāng)大的比例。
　　 CS2具有多系統(tǒng)毒性,可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的

2、慢性損傷,對(duì)視覺系統(tǒng)、聽覺系統(tǒng)、前庭功能、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)都有一定的影響。在對(duì)生殖毒性的研究中發(fā)現(xiàn),CS2可導(dǎo)致男工性功能障礙,睪丸萎縮,精子數(shù)目減少、活動(dòng)力下降和畸形精子增多；接觸CS2女工多見月經(jīng)周期異常、痛經(jīng)、經(jīng)期延長、血量增多,更嚴(yán)重的可引起懷孕女工自然流產(chǎn)、死胎死產(chǎn)等現(xiàn)象。本課題組對(duì)欲生育的CS2作業(yè)女工進(jìn)行前瞻性研究發(fā)現(xiàn),CS2作業(yè)女工受孕時(shí)間延長,使該作業(yè)女工獲得一次臨床可識(shí)別妊娠的概率明顯降低；另外發(fā)現(xiàn)早早孕丟失率增

3、加,近半數(shù)受精卵不能正常著床而丟失。說明CS2對(duì)胚胎早期發(fā)育有損傷作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CS2的胚胎毒性并探討其毒作用機(jī)制,本課題組建立了小鼠動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),卵泡發(fā)育期和胚胎植入期暴露CS2,均可導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育障礙和胚胎植入數(shù)目減少,并發(fā)現(xiàn)胚胎植入期是CS2致胚胎發(fā)育毒性的一個(gè)敏感毒作用位點(diǎn),但是目前關(guān)于胚胎植入障礙機(jī)制尚不清楚。已知良好的子宮內(nèi)膜容受性是胚胎順利植入的前提條件,但關(guān)于子宮內(nèi)膜容受性的問題研究報(bào)道甚少,尚缺少用于

4、篩選和評(píng)價(jià)早期生殖損傷效應(yīng)的敏感觀察指標(biāo)。以上問題對(duì)職業(yè)性CS2暴露女工勞動(dòng)保護(hù)措施的修訂和實(shí)施至關(guān)重要。
　　 研究目的：
　　 建立植入期CS2暴露致胚胎毒性動(dòng)物模型,檢測(cè)植入期CS2暴露對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡的影響作用,分析小鼠胚胎毒性、子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡程度與CS2暴露強(qiáng)度之間關(guān)系,以揭示植入期CS2暴露致胚胎毒作用機(jī)理,為CS2暴露女工職業(yè)勞動(dòng)保護(hù)措施的修訂和實(shí)施提供理論依據(jù)。

5、　　 研究方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 1.1胚胎植入期小鼠CS2暴露,孕9天(GD9)觀察胚胎毒性；
　　 1.2獲取胚胎植入期小鼠子宮內(nèi)膜,制備單細(xì)胞以建立利用小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞檢測(cè)DNA損傷的研究方法,利用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)CS2致DNA損傷的敏感性；
　　 1.3胚胎植入期小鼠 CS2暴露(體內(nèi)實(shí)驗(yàn)),GD5獲取子宮內(nèi)膜,制備單細(xì)胞懸液,用SCGE技術(shù)檢測(cè)DNA損傷；
　　 1.4胚胎

6、植入期小鼠CS2暴露,制備GD5子宮內(nèi)膜細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡；
　　 1.5胚胎植入期小鼠暴露CS2,制備GD5子宮組織石蠟切片,用TUNEL方法測(cè)定細(xì)胞凋亡。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:
　　 清潔級(jí)8-12w性成熟昆明種(KM)小鼠,雌性體重為27-30g；雄性小鼠30-35g,單籠飼養(yǎng)。雌鼠與雄鼠1:l合籠受孕。查到陰栓日即為孕1天(GD1),按體重隨機(jī)分組

7、。
　　 3.促排卵處理:
　　 腹腔注射10U PMSG,48h后腹腔注射10U HCG。
　　 4.染毒處理:
　　 染毒時(shí)間:GD4.5,單次暴露；
　　 染毒劑量:0.1 LD50(即631.4mg/kg)為低劑量,0.2 LD50為中劑量,0.4 LD50為高劑量；溶劑為橄欖油；
　　 染毒方式:腹腔注射；
　　 染毒容積:0.1ml/10g體重。
　　 5.實(shí)驗(yàn)

8、方法:
　　 5.1單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù):參考Singh方法稍作改進(jìn),建立適用于檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。熒光顯微鏡采集圖像,CASP系統(tǒng)自動(dòng)分析各項(xiàng)指標(biāo),SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。
　　 5.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胚胎植入期子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡:制備子宮內(nèi)膜細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡程度。
　　 5.3脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TONEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:

9、制備石蠟切片后,根據(jù)羅氏公司TUNEL試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度。
　　 6.統(tǒng)計(jì)分析方法
　　 采用SPSS16.0建立數(shù)據(jù)庫,測(cè)量結(jié)果均以(x)±s表示；方差齊性時(shí)采用F
　　 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Brown-Forsythe統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)；采用最小顯著差(LSD)t檢驗(yàn)方法進(jìn)行樣本間兩兩比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.胚胎植入期暴露CS2致小鼠胚胎毒性研究結(jié)

10、果
　　 胚胎毒性:高、中、低劑量暴露組小鼠胚胎植入數(shù)目明顯降低,分別比對(duì)照組減少了32.3％、65.1％和67.4％(P<0.05)；宮胚重明顯降低,分別比對(duì)照組減少了40.3％、57.9％和71.9％(P<0.05)；胚胎總重均明顯降低,分別比對(duì)照組減少了54.7％、68.2％和85.4％(P<0.05)；校正胚胎植入數(shù)后,各組的胚胎均重與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 母體毒性:胚胎植入孕鼠的體

11、重增加值和肝臟重量變化均不明顯(P>0.05),母體毒性較小。
　　 2.胚胎植入期暴露CS2致小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷的研究結(jié)果
　　 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:建立單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)方法,在熒光顯微鏡下可見正常細(xì)胞和較為典型彗星細(xì)胞圖像。不同暴露劑量的Head DNA％、Tail DNA％、TL、CL、TM、OTM與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Head DNA％、Tail

12、DNA％、TL、TM、OTM與暴露劑量之間回歸系數(shù)分別為-13.78、13.78、0.05、4.38、3.23(P<0.01)。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:低、中、高劑量暴露組的DNA損傷指標(biāo)Head DNA％、TailDNA％、TL、CL、TM與對(duì)照組相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。中劑量、高劑量暴露組的OTM比對(duì)照組增加了5.88和9.21倍(P<0.01)。Head DNA％、Tail DNA％、TL、TM、OTM與

13、暴露劑量的回歸系數(shù)分別為-0.021、0.021、0.014、0.043、0.062,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.胚胎植入期暴露CS2致小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果
　　 植入期小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡結(jié)果:Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),中劑量和高劑量暴露組與對(duì)照組相比,凋亡率分別增高89.26％、274.50％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　

14、TUNEL方法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率的變化情況發(fā)現(xiàn),中劑量和高劑量暴露組的凋亡率與對(duì)照組相比,凋亡率分別增高89.9％、121.8％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),此結(jié)果和Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)的結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.胚胎植入期CS2暴露可導(dǎo)致明顯的胚胎毒性,表現(xiàn)為各暴露劑量小鼠胚胎植入數(shù)目明顯減少,存在胚胎丟失現(xiàn)象。
　　 2.胚胎植入期CS2暴露可造成子宮內(nèi)膜細(xì)胞