多發(fā)性硬化患者糖皮質(zhì)激素受體與療效的相關(guān)性研究.pdf

1、研究目的： 1、動態(tài)觀察PBMCs中GR蛋白水平數(shù)量，了解臨床上癥狀加重和或GC療效不佳的原因，指導(dǎo)臨床合理用藥。 2、從蛋白水平和mRNA水平對GR的表達進行觀察，判斷療效的差異是否與受體翻譯水平和或受體轉(zhuǎn)錄水平異常有關(guān)。 3、比較不同類型MS患者內(nèi)源性皮質(zhì)醇濃度的變化及其與GR的關(guān)系。 4、觀察用藥前后EDSS的變化是否與GR蛋白表達水平相關(guān)。 材料與方法： 1、臨床資料 1.

2、1、病例來源 35例MS患者(包括：復(fù)發(fā)緩解型MS、繼發(fā)進展型MS)、9例視神經(jīng)脊髓炎患者和10例臨床孤立綜合征患者均選自2005年3月～2006年1月于中山大學附屬第三醫(yī)院就診的住院患者。45例健康對照為廣州市中心血站的自愿獻血者。病例組和對照組性別與年齡均無顯著性差異。 1.2、病例入選標準 傳統(tǒng)型MS診斷標準符合McDonald等2001年提出的診斷標準；NMO患者符合Wingerchuk等1999年提出的

3、NMO診斷標準；CIS患者系排除了其他疾病的臨床具有MS的特征性表現(xiàn)，無MRI陽性表現(xiàn)或是輕微的脫髓鞘表現(xiàn)。1.3、標本采集 于GC沖擊治療前(采血前3個月內(nèi)未使用過免疫抑制劑，GC應(yīng)用者美卓樂用量不多于24mg/d)、治療中(沖擊治療第4天)、治療后第14天上午6-8時取靜脈血；健康對照組早8時抽取靜脈血；分別進行GR、GRmRNA及血漿空腹皮質(zhì)醇檢測。 1.4、結(jié)果判斷標準 指標正常值 空腹皮質(zhì)醇濃度

4、早晨空腹190.2～618.Onmol/L； GR蛋白數(shù)量3000-6000(位點/細胞) GRmRNA電泳結(jié)果使用凝膠成像分析系統(tǒng)(型號：UVPGDS-8000)進行灰度分析。 2、實驗材料與儀器 2.1、放射配體結(jié)合法測定GR蛋白水平數(shù)量： 2.1.1、主要試劑與材料： 磷酸鹽緩沖液PBS(pH：7.2～7.4)、超純水系統(tǒng)、淋巴細胞分離液、二甲苯、PPO(進口分裝)第一閃爍液、POP

5、OP(進口分裝)第二閃爍液、[3H]Dex、非標地塞米松、肝素抗凝硅化管、49型玻璃纖維濾膜、移液槍。 2.1.2、主要儀器： 酸度計(PH計)、倒置顯微鏡、震蕩水浴箱、多頭細胞收集器、液體閃爍計數(shù)器、烘箱、臺式高速冷凍離心機。 2.2、RT-PCR法測定GRmRNA的表達： 2.2.1、主要試劑與材料： 磷酸鹽緩沖液PBS(pH：7.2～7.4)，酸度計(PH計)、超純水系統(tǒng)、淋巴細胞分離液，總

6、RNA提取試劑盒(TRIzol)，氯仿(無RNA酶)、100％異戊醇(無RNA酶)、100％無水乙醇(無RNA酶)，DEPC，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒、上樣液(Gelloadingbuffer)、DNAMarker、15ml塑料離心管；1ml、0.5ml、0.2mlEP管，1ml、200ul、10ul槍頭；1ml、200ul、10ul移液槍；濾紙；制膠模具；瓊脂糖。 2.2.2、主要儀器 超凈工作臺，大容量低速離

7、心機，小型高速離心機，漩渦混合器，臺式高速冷凍離心機；核酸蛋白分析儀；電泳儀；電泳槽；凝膠成像分析系統(tǒng)。 2.3、空腹皮質(zhì)醇的檢測 使用皮質(zhì)醇磁性分離酶聯(lián)免疫測定法試劑盒進行檢測。 3、實驗方法與步驟 3.1、GR蛋白測定的實驗方法與步驟： 使用放射配體結(jié)合法檢測。首先分離3ml肝素抗凝血中的單核細胞，用PBS液(PH=7.4)將分離出的細胞調(diào)成106個/ml懸液，將該懸液分成兩管，一管加等量[3

8、H]Dex15mol/L作為總結(jié)合管(TB)，另一管加等量的[3H]Dex，再加2000倍非標Dex為非特異結(jié)合管(NSB)。置30℃震蕩水浴箱中30分鐘，冰凍蒸餾水滴入試管終止反應(yīng)，用多頭細胞收集器抽提，加閃爍液4ml(含二甲苯、POP、POPOP)過夜待測，將閃爍杯移至液體閃爍計數(shù)器計數(shù)測量。每種管均設(shè)有兩個平行管，所測出的數(shù)據(jù)行平均處理。 3.2、GRmRNA檢測的方法與實驗步驟： 利用半定量RT-PCR法檢測，首

9、先分離新鮮靜脈血中的PBMCs并作細胞計數(shù)及細胞活力檢測；提取PBMCs中總RNA，電泳驗證RNA的完整性；將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；合成目的基因及內(nèi)參基因引物；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴增目的基因；利用電泳技術(shù)分離目的條帶并進行半定量分析。 3.3空腹皮質(zhì)醇的檢測： 送我院內(nèi)分泌實驗室進行檢測，步驟略。 4、統(tǒng)計及分析方法 使用MicrosoftExecel2003制圖、SPSS11.5forwindows統(tǒng)計

10、分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。首先對計量資料進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，用F檢驗進行兩樣本方差齊性檢驗，當兩獨立樣本符合正態(tài)分布且方差齊時，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，方差不齊時采用校正t'檢驗；對治療前中后的所得數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗，以P≤0.05作為有顯著性差異。對不同觀測指標間是否存在線性關(guān)系，使用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗。 結(jié)果： 1、RRMS、SPMS患者治療前PB

11、MCs中GR蛋白數(shù)量顯著低于健康對照組，治療后RRMS患者的GR蛋白數(shù)量與健康對照組無顯著性差異，SPMS患者GR蛋白數(shù)量仍顯著低于健康對照組；NMO和CIS患者治療前、后PBMCs中GR蛋白數(shù)量與健康對照組均無顯著性差異。 2、各組患者在GC沖擊治療中GR蛋白數(shù)量均有顯著性下降。 3、各組患者血漿皮質(zhì)醇濃度在治療前、后與對照組均無顯著性差異。 4、RRMS和NMO患者治療后EDSS較治療前顯著下降，SPMS患者

12、EDSS治療前后無顯著變化。 5、RRMS患者治療前后GR蛋白數(shù)量和EDSS存在線性負相關(guān)。 6、MS患者治療前GR蛋白數(shù)量與治療前后EDSS的差值無相關(guān)性。 7、RRMS患者PBMCs中GRαmRNA的表達與健康對照組無顯著性差異，SPMS患者PBMCs中GRαmRNA的表達顯著低于健康對照組。 8、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表達水平均顯著高于健康對照組，SPMS患者的GRβmR

13、NA表達水平顯著高于RRMS患者。 9、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表達分別占相應(yīng)GRαmRNA的43.98±10.75％和140.01±192.90％。SPMS患者治療前GRβmRNA表達水平與治療前后EDSS的差值呈線性負相關(guān)。 結(jié)論： 1、MS患者體內(nèi)的GC產(chǎn)生和代謝正常，GR蛋白數(shù)量異常，提示MS患者可能存在GC-GR系統(tǒng)功能紊亂，GR降低可能與MS的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。 2、G

14、C沖擊治療中，癥狀一過性加重與GR蛋白數(shù)量顯著性下降相關(guān)，RRMS患者GR蛋白數(shù)量與EDSS相關(guān)。 3、GRαmRNA的表達水平顯著降低和或內(nèi)源性抑制因子GRβmRNA表達水平顯著升高可能是導(dǎo)致MS患者功能性受體蛋白數(shù)量減少的原因之一。 4、GRβmRNA相對低水平表達可能對GR蛋白活性無明顯影響。 5、MS患者PBMCs中GRmRNA表達水平的變化可以提示GR的活性狀態(tài)，GR功能性蛋白數(shù)量的檢測是預(yù)測臨床GC療