人老化髓核細胞的炎性因子表達變化分析.pdf

1、目的:
　　研究體外培養(yǎng)人類正常和退變腰椎間盤髓核細胞的基因表達譜，分析人老化髓核細胞的炎性因子表達變化。
　　方法:
　　1、體外傳代培養(yǎng)人正常髓核細胞系(Scien Ce114800)。連續(xù)性1∶3傳代、培養(yǎng)（理論上可傳至13代），誘導髓核細胞復制性老化。
　　2、取P8代髓核細胞按1×106個/孔接種于六孔板，按雙氧水濃度100μmol/L、作用時間2h/天、連續(xù)四天處理，氧化應激誘導髓核細胞過早老化。

2、r>　　3、分別對步驟1中每一代細胞及步驟2中的細胞老化前及應激誘導老化后行顯微鏡下觀察髓核細胞的形態(tài)、SA-β-Gal染色并計數(shù)細胞老化率，制備兩組髓核細胞老化模型。（注:因目前尚無公認的髓核細胞老化模型標準，本研究中擬定老化率≥80％、G1期細胞≥80％造模組為合格的髓核細胞老化模型。）
　　4、取P9代髓核細胞（老化陰性對照組）、復制性老化模型、應激誘導的P9代過早老化模型3組細胞，采用實時定量RT-PCR檢測3組細胞TNF

3、-α及IL-1β、IL-6、IL-8等的相對表達含量。
　　結果:
　　1、在誘導髓核細胞復制性老化的過程中，隨著細胞傳代次數(shù)的增加，髓核細胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長梭形、不規(guī)則形等形態(tài)轉變。細胞體積逐漸增大、胞質變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計數(shù)髓核細胞老化率、流式細胞儀檢測G1期細胞比例均逐漸增加，傳至P13代時三者比例分別為81.1％、84.5％，差異與正常P9代髓核細胞相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.

4、05)。
　　2、在氧化應激誘導髓核細胞過早老化的過程中，隨著雙氧水作用天數(shù)的延長，細胞形態(tài)逐漸由類圓形向長梭形轉變，細胞體積增加、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計數(shù)髓核細胞的老化率、流式細胞儀檢測G1期細胞比例均逐漸增大，且100μmol/L雙氧水作用P9代髓核細胞2h/天、連續(xù)四天后三者比例分別為80.3％、80.6％，差異與正常P9代髓核細胞相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、RT-PCR實驗結果顯示，在

5、復制性老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達量較對照組均有所增加，差異較對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在應激誘導的過早老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達量較對照組均有所增加，差異較對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。復制老化模型組增幅與應激老化模型組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達量相近，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　1、通過連續(xù)性

6、傳代培養(yǎng)人正常髓核細胞系(Scien Cell4800)，成功建立髓核細胞復制性老化模型(P13代髓核細胞);
　　2、通過100μmol/L雙氧水作用于P9代髓核細胞2h/天，連續(xù)作用四天，成功建立應激誘導的髓核細胞過早老化模型;
　　3、在髓核細胞復制性老化與雙氧水誘導應激老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表達量均較正常P9代對照組明顯增高;
　　4、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在