人類癌抗原在原發(fā)性肝癌上的鑒定.pdf

1、原發(fā)性肝癌之所以死亡率高，缺乏早期診斷是主要原因之一，而已有的AFP在肝癌診斷上只有60％左右的陽性率。如果能找到相對肝癌特異的蛋白和基因單獨(dú)或與AFP聯(lián)合檢測，將會對研究肝癌的發(fā)病機(jī)制以及提高早期診斷有重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)人類癌抗原(Human Carcinoma Antigen，HCA)作為一種糖蛋白復(fù)合物在癌癥中廣泛表達(dá)，其蛋白成分具有腫瘤相對特異性。尋找特異性的肝癌相關(guān)的HCA分子為提高原發(fā)性肝癌的早期檢出率以及了解肝癌的生

2、物學(xué)行為和靶向治療提供了新線索和新依據(jù)。 總的來說，某些腫瘤能產(chǎn)生和分泌粘蛋白，而正常組織不產(chǎn)生。人類癌抗原(Human Carcinoma Antigen，HCA)就是一種分子量很大的粘蛋白樣糖蛋白，它在人腫瘤組織或腫瘤患者的體液以及血液中高表達(dá)。因此，腫瘤患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)的HCA可以作為腫瘤的標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道它能夠被其鼠類同源物epiglycanin(EPGN)的抗體HAE3識別。但是目前HCA的組成成分和功能未知，而且其抗

3、體亞類為IgM，不能滿足將來臨床應(yīng)用的需要。另一方面HCA在肝癌組織上有無表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用從腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中純化的HCA作為免疫原免疫balb/C小鼠，制備出高親和力、高特異性并且針對不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的鼠抗人HCA單克隆抗體。然后用正常肝組織，肝癌組織，肝癌細(xì)胞系HepG2和前列腺癌細(xì)胞系PC3的總蛋白對獲得的抗體進(jìn)行Western-blot和免疫組化的篩選，篩選出21株單克隆抗體能特異性識別腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系

4、中的蛋白；發(fā)現(xiàn)其中抗HCA抗體(BCE075)所識別的抗原在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，陽性染色定位于毛細(xì)膽管及小葉間膽管形成的類腺管樣結(jié)構(gòu)，BCD021在肝癌組織和HepG2中陽性表達(dá)，正常肝組織與正常肝細(xì)胞L-02不表達(dá)，陽性染色定位于肝癌細(xì)胞。并且這兩株抗體與目前臨床上常用的糖蛋白類腫瘤標(biāo)志物之間無交叉反應(yīng)，推測它們識別的為一新的肝癌相關(guān)抗原。進(jìn)一步的我們應(yīng)用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)潛技術(shù)鑒定其抗原，初步認(rèn)定單克隆抗體BCD021識別的抗原為Cyt

5、oskeleton-associated protein4(CKAP4)，單克隆抗體BCE075識別的抗原可能為CKAP4與Brain glycogen phosphorylase(PYGB)等的復(fù)合物。并對此進(jìn)行了初步驗(yàn)證。 一、抗HCA單克隆抗體的制備和鑒定： 目的：運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備HCA的IgG單克隆抗體，為進(jìn)一步研究HCA的結(jié)構(gòu)及功能提供有力的工具。并對單克隆抗體在尋找腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用上進(jìn)行評價。 方法

6、：用現(xiàn)有的HCA-IgM抗體HAE3分別從PC3、PCaT及LCaT總蛋白中分離純化得到三組糖蛋白復(fù)合物組分作為抗原分別免疫Balb/c小鼠，獲得鼠抗人HCA抗體，并對這些抗體進(jìn)行ELISA效價檢測、western-blot以及與其它糖蛋白標(biāo)志物的交叉反應(yīng)等分析，篩選合適的抗體進(jìn)行下一步研究。 結(jié)果：共制備出62株高親和力、高特異性并且針對不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的鼠抗人HCA單克隆抗體。而且無論效價、western-blot等都適合進(jìn)

7、行進(jìn)一步研究。 結(jié)論：我們利用天然HCA抗原制備了高親和力，高特異性并且針對不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體。上述抗體的一般特性符合我們的要求，可應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)、定位、功能等常規(guī)的生命科學(xué)研究，為我們研究其結(jié)構(gòu)及功能提供了有力的特異的工具。 二、抗HCA單克隆抗體在肝細(xì)胞癌以及膽管細(xì)胞癌上的應(yīng)用： 目的：本部分試驗(yàn)主要檢驗(yàn)肝細(xì)胞癌以及膽管細(xì)胞癌有無HCA的表達(dá)。 方法：利用62株HCA單抗在肝癌組織以及細(xì)胞系

8、再次western-blot以及免疫組化篩選單抗，發(fā)現(xiàn)BCD21與BCE075兩株抗體特異性強(qiáng)，我們著重將這兩株抗體分別在60例肝細(xì)胞癌以及膽管細(xì)胞癌中進(jìn)行western-blot或者免疫組化分析。 結(jié)果：通過上述方法篩選出的20余株HCA單抗在肝癌中高表達(dá)，其中以BCD021與BCE075作為代表，BCE075所識別的抗原是一組糖蛋白復(fù)合物，在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，陽性染色定位于毛細(xì)膽管及小葉間膽管形成的類腺管結(jié)構(gòu)。BCD021

9、所識別的抗原是糖蛋白復(fù)合物組分中的一種蛋白，在肝癌組織和HepG2細(xì)胞中陽性表達(dá)，正常肝組織和L-02細(xì)胞不表達(dá)，陽性染色定位于肝癌細(xì)胞。BCE075在膽管細(xì)胞癌上表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)在膽管細(xì)胞形成的腺管以及腺腔分泌物上。 結(jié)論：通過Western-blot及免疫組織化學(xué)分析，我們篩選到2株抗體(BCD021及BCE075)識別的抗原在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。從而為進(jìn)一步研究肝癌相關(guān)HCA抗原的結(jié)構(gòu)及功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時為發(fā)現(xiàn)新的肝

10、癌相關(guān)抗原提供了新線索。 三、肝細(xì)胞癌相關(guān)HCA分子的鑒定與驗(yàn)證： 目的：本部分試驗(yàn)主要鑒定肝細(xì)胞癌相關(guān)王：ICA的組成部分以及進(jìn)行初步的驗(yàn)證。 方法：利用兩株HCA單克隆抗體BCD021以及BCE075從肝癌組織和肝癌細(xì)胞中進(jìn)行免疫沉淀和質(zhì)譜檢測，并對質(zhì)譜檢測出來的蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證。(Western-blot、免疫沉淀等) 結(jié)果：免疫沉淀與質(zhì)譜檢測初步證實(shí)了單克隆抗體BCD021識別的抗原為Cytoske

11、leton-associated protein4(CKAP4)，單克隆抗體BCE075識別的抗原可能為CKAP4與Brain glycogen phosphorylase(PYGB)等的復(fù)合物。PCR以及免疫組化發(fā)現(xiàn)CKAP4在肝癌組織中高表達(dá)，正常組織中低表達(dá)。通過免疫沉淀等方法證實(shí)了CKAP4是肝癌相關(guān)HCA的一個重要組分。 結(jié)論：通過單克隆抗體技術(shù)以及免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)尋找腫瘤相關(guān)分子是可行的。 小結(jié)：本試驗(yàn)通