一種肝癌細胞特異性抗體的靶抗原鑒定及該抗原在肝癌組織中的表達研究.pdf

1、采用各種展示文庫篩選腫瘤細胞特異性抗體在二十世紀(jì)八、九十年代就已經(jīng)開始。但是，針對腫瘤細胞篩選到的這些抗體的抗原鑒定則較困難。雖然篩選到了一些腫瘤細胞特異性抗體，但是只有少部分抗體所識別的抗原被鑒定出來。其主要原因是蛋白質(zhì)微量鑒定技術(shù)發(fā)展滯后。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)催生了許多新技術(shù)，其中質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得其在蛋白質(zhì)的分析和鑒定中發(fā)揮著不可替代的作用。PMF或者LC-MS/MS是目前最常用的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)。 scFvN14抗體是我們

2、針對HepG2細胞篩選得到的一株單鏈抗體。該抗體能特異識別HepG2肝癌細胞，而對正常肝細胞株L02細胞反應(yīng)較弱。本研究的目的是利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，鑒定scFvN14抗體所識別的抗原，分析該抗原與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。 首先，利用pET-scFvN14原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)LysS細胞，實現(xiàn)了scFvN14抗體的高表達。表達的scFvN14以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)裂解后，采用金屬離子螯合

3、柱輔助復(fù)性技術(shù)實現(xiàn)了scFvN14抗體的有效復(fù)性。利用純化的抗體，通過Westernblot實驗證明，scFvN14抗原在HepG2肝癌細胞中的表達量要高于正常肝細胞株L02細胞中的表達量；采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)分析了scFvN14抗原的亞細胞定位，結(jié)果顯示，scFvN14抗原主要定位于細胞核。 由于scFvNl4抗原的細胞核定位，選取HepG2肝癌細胞的細胞核蛋白作為scFvN14抗原鑒定的起始材料。通過一維電泳和Western

4、blot(1D/WB)實驗發(fā)現(xiàn)，scFvN14能夠特異地識別HepG2細胞核蛋白組份中分子量約37kD和35kD的兩個蛋白條帶。通過Q-TOF對這兩個蛋白條帶中的蛋白進行了鑒定，其中37kD條帶中的蛋白可能是annexinA2isoform2、glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、hnRNPproteinA2和mutantbeta-actin(beta'-actin)；35kD條帶中的蛋白則可能

5、是hnRNPA2、unnamedproteinproduct和transformationupregulatednuclearprotein。由于兩條帶中包含的蛋白均有hnRNPA2，而編碼hnRNPA2的基因能夠通過不同的mRNA剪切方式編碼hnRNPA2和hnRNPB1兩種蛋白，hnRNPB1比hnRNPA2的N末端多12個氨基酸。所以，很可能37kD條帶中的蛋白是hnRNPBl，35kD條帶中的蛋白是hnRNPA2，而scFvN1

6、4抗體能夠同時識別hnRNPA2和hnRNPB1。為了確證這一推測，我們又通過二維電泳/Westernblot/質(zhì)譜技術(shù)進一步證明，hnRNPA2/B1即是scFvN14抗原。之后，又采用ELISA和Westernblot實驗，檢測scFvN14抗體能否特異識別重組hnRNPA2蛋白，結(jié)果表明，scFvN14的確能識別重組hnRNPA2蛋白。 hnRNPA2/B1蛋白是一種肺癌早期標(biāo)志物，但有文獻指出hnRNPA2/B1可能在肝

7、癌細胞中不存在高表達現(xiàn)象。為了了解hnRNPA2/B1與肝癌之間的關(guān)系，通過半定量PCR和Westernblot實驗比較了hnRNPA2/B1蛋白在大鼠正常肝細胞和兩種大鼠肝癌細胞株RH35、7919細胞中的表達，結(jié)果表明，hnRNPA2/B1在兩種肝癌細胞中均高表達，而在大鼠正常肝細胞中表達較低。半定量PCR實驗還表明，hnRNPB1的表達水平在肝癌細胞和正常肝細胞中存在明顯差異，肝癌細胞中hnRNPB1的表達水平明顯偏高。另外，研究

8、還表明，正常肝細胞和肝癌細胞均不分泌hnRNPA2/B1蛋白。 為了進一步了解hnRNPA2/B1與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，對正常肝組織和病變肝組織中的hnRNPA2/B1的表達進行了免疫組化分析，共檢測了3例正常肝組織、10例肝炎組織和36例肝癌組織。結(jié)果顯示，hnRNPA2/B1蛋白在正常肝組織中基本不表達或者表達非常弱；在肝炎組織中，hnRNPA2/B1蛋白高表達，并僅分布于細胞核中；在肝細胞癌組織中，hnRNPA2/B1

9、蛋白高表達，但其分布與肝癌的病理分期存在一定的相關(guān)性。在低分化的肝癌組織中，hnRNPA2/B1主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)分布；在高分化的肝癌組織中，hnRNPA2/B1多數(shù)定位于細胞核，或者核質(zhì)均有分布，完全細胞質(zhì)分布的很少。hnRNPA2/B1在肝癌組織中的高表達以及其亞細胞定位與肝癌組織病理分期的相關(guān)性提示，hnRNPA2/B1可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 總之，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，成功鑒定了scFvNl4抗體所識別的抗