MnC12對大鼠睪丸支持細(xì)胞ABP、Tf和INHB mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:生殖健康是近些年討論的熱點(diǎn)，男性精液的質(zhì)和量呈逐漸下降趨勢，其影響因素是多方面的，環(huán)境污染是重要影響因素。在中國，由于生產(chǎn)工藝和技術(shù)的落后，以及管理不善，環(huán)保觀念的薄弱，使得近些年的重金屬污染情況日趨嚴(yán)重。錳作為重金屬的一種，既是人體所需的微量元素之一，又是職業(yè)危害因素之一。錳參與人體的多種功能活動(dòng)，微量的錳被機(jī)體吸收后，可進(jìn)入睪丸組織參與精子的生成。錳缺乏時(shí)會(huì)出現(xiàn)性欲低下和不育，表現(xiàn)為生殖功能抑制，精子成熟受阻等；但過量的錳也會(huì)

2、對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響，現(xiàn)有的研究表明，過量的攝入錳會(huì)對雄性生殖系統(tǒng)造成損傷，使睪丸萎縮、精子數(shù)量減少、畸形精子數(shù)增加等。
　　 該實(shí)驗(yàn)研究中，以原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞(SC)為模型，以氯化錳(MnCl2)為染毒物，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time Q—PCR)和Westernblot方法檢測MnCl2對支持細(xì)胞雄激素結(jié)合蛋白(ABP)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和抑制素B(INH B)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量的影響，探討

3、MnCl2對雄性生殖功能影響的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究Mn對雄性生殖系統(tǒng)的毒性提供理論支持。
　　 方法:
　　 1．支持細(xì)胞體外培養(yǎng)：選取18～20d的清潔級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠，分離提取Sertoli細(xì)胞。
　　 2．Cell Counting Kit—8(CCK—8)法檢測細(xì)胞生長狀態(tài)：將Sertoli細(xì)胞以細(xì)胞濃度為2．0×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每板接種6個(gè)復(fù)孔，在450 nm測

4、吸光度，繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 3．MTT法確定染毒濃度：以1．0×10—2mol/L、1．0×10—3 mol/L、1．0×10—4 mol/L、1．0×10—5 mol/L、1．0×10—6 mol/L、1．0×10—7 mol/L、1．0×10—8mol/L、1．0×10—9mol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli細(xì)胞，培養(yǎng)24h，用酶標(biāo)儀在492nm測量吸光度，確定染毒濃度。
　　 4．熒光實(shí)時(shí)定量PCR

5、法檢測ABP、Tf和INH B mRNA的表達(dá)量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli細(xì)胞，染毒24h，提取Sertoli細(xì)胞的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，檢測ABP、Tf和INH B mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 5．Western blot法檢測ABP、Tf和INH B的蛋白表達(dá)量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli

6、細(xì)胞，提取Sertoli細(xì)胞的蛋白，用Westernblot法檢測ABP、Tf和INHB的蛋白相對表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1．細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果：通過兩步酶法，提取的SD大鼠支持細(xì)胞存活率達(dá)到95％以上，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞基本完全鋪開，生長良好，經(jīng)胰酶純化后Sertoli細(xì)胞純度達(dá)90％以上。
　　 2．CCK—8法測定結(jié)果：培養(yǎng)4～8 d的細(xì)胞數(shù)量相對比較穩(wěn)定，代謝旺盛，選擇培養(yǎng)至第5d的細(xì)胞進(jìn)行研究。

7、　　 3．MTT法測定結(jié)果：檢測各染毒組處理24 h后的Sertoli細(xì)胞OD值，經(jīng)計(jì)算，IC50=200μmol/L，選擇1/4 IC50、1/2 IC50和IC50，即50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L為染毒濃度。
　　 4．熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：各濃度組Sertoli細(xì)胞ABP、Tf和INH B mRNA均能持續(xù)表達(dá)，三者的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在各染毒組均降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8、>　　 5．Western blot結(jié)果：ABP蛋白相對表達(dá)量在各染毒組均降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Tf的蛋白相對表達(dá)量在100μmol/L和200μmol/L兩個(gè)濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；INH B的蛋白相對表達(dá)量在200μmol/L濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:氯化錳在該染毒劑量下可降低Sertoli細(xì)胞ABP、Tf和INH B mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)水平，提示氯化錳可能通過抑制A