RAS-siRNA阻斷RAS通路并抑制人食管鱗癌的實驗研究.pdf

1、食管癌是我國常見的惡性腫瘤，而我國是世界上食管癌的高發(fā)國家，也是目前世界上食管癌死亡率最高的國家之一，具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉移和死亡率高等特點，且發(fā)病年齡又有年輕化趨勢，目前臨床工作中對食管癌的治療仍是以外科手術、放化療為主要治療方法。而手術雖能很快地去除癌病灶，但臨床許多中晚期食管癌患者已發(fā)生遠處轉移，失去了手術指征，且術后極易復發(fā)轉移，放化療雖然能在近期緩解患者癥狀，縮小病灶，但遠期療效不理想，且不可避免的毒副作用使許多患者最

2、終死亡，因此尋找新的治療方法，改善食管癌患者臨床癥狀，提高生存質量，延長生存期，具有非常重要的現實意義。
　　食管癌的增殖、侵襲及轉移是一個多基因調控、多因素作用、多階段步驟的復雜過程。研究表明，信號傳導通路(Ras/MEK(MAPKK)/MAPK及細胞周期蛋白(cyclin)被證實與腫瘤的增殖侵襲轉移有較為密切的關系，有關基因治療和信號通路的傳導及調控異常在腫瘤研究中的作用日益前沿，其中Ras癌基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系十分密切，

3、Ras蛋白在細胞增殖過程中發(fā)揮至關重要的作用，其在Ras通路中作為一種開關蛋白，控制著增殖信號的傳導，Ras蛋白的“開”“關”狀態(tài)的轉換調節(jié)著細胞的生理功能和信號傳導，人類實體瘤中往往有Ras基因族的突變，Ras基因至少存在于30％的人類癌癥中，而Ras/MAPK信號通路中的MAPK是將Ras蛋白下傳的重要信號傳遞分子。Ras信號傳導通路包括:生長因子受體(EGFR)→含有SH2結構域的接頭蛋白(Grb2)→核苷酸釋放因子(SOS)→R

4、as蛋白→Raf(MAPKKK)→MEK(MAPKK)→絲/蘇蛋白激酶(MAPK)→轉錄因子→DNA合成。因此，從Ras到MAPK是有一組酶兼底物的蛋白分子組成的鏈狀信號傳導途徑，由MAPKKK、MAPKK、MAPK組成的激酶級聯系統(tǒng)，使Ras傳來的信號得以逐級放大和傳遞。MAPK被激活后，轉至細胞核內，直接激活轉錄因子.該因子與myc基因旁的特異的DNA序列結合，從而啟動轉錄。myc基因產物也是轉錄因子，它能激活其他基因，最終，這些信

5、號集中起來誘導D型Cyclin的表達和活性，D型Cyclin與Cyclin依賴性激酶(如CDK4和CDK6)形成復合體，該復合體的形成促使細胞從G1期進入S期。因此，Ras/MAPK通路在受體信號和G1期進展之間起著關鍵作用。
　　細胞周期的進程受細胞周期蛋白(cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDKI)等調控因子及其之間的相互作用來調節(jié)。這種調節(jié)是通過視網膜母細胞癌基因產物Rb蛋白來

6、實現的。Rb蛋白對細胞周期中最關鍵的調控點G1/S期、G2/M期起著“閘門”的作用，Rb蛋白的磷酸化和非磷酸化最終決定細胞周期的進程。與細胞衰老有關的細胞周期調控信號因子及途徑較為復雜，如CDK復合體的正調控因子PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）和MAPK（有絲分裂原活性激酶）以及負調控因子p16ink4a、p21waf1、p27kip1等。一些原癌基因Ras、JNK（c2junN端激酶）及MAPK/ERK（胞外信號調控激酶）等，正常表達可促

7、進細胞周期，而當超常表達時則可誘導CDKI的表達進而導致細胞周期阻滯。
　　近些年來，在對食管癌細胞Ras/MEK(MAPKK)/MAPK信號傳導通路的研究中，運用siRNA沉默RAS基因，研究RAS/MAPK通路與細胞周期、細胞的增殖侵襲凋亡及食管癌的發(fā)生發(fā)展的關系，至今在國內外尚未見報道。為了探討Ras/MEK(MAPKK)/MAPK腫瘤信號傳導通路及RNA干擾技術對食管癌Ras、MAPK、cyclinD1的影響及在食管癌治療

8、中的應用價值，本研究擬從組織學、細胞學、動物實驗等方面，系統(tǒng)研究siRNA-Ras后，RAS/MAPK信號通路中RAS、MAPK及cyclinD1的表達變化及食管鱗癌細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學功能的變化，為臨床治療食管癌提供一定的研究依據。
　　第一部分RAS、mapk及cyclinD1在人食管鱗癌組織中的表達
　　方法：
　　1、將臨床收集的105例食管鱗癌組織石蠟切片，分為正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組

9、、轉移、未轉移組及浸潤程度深和淺組，用免疫組化方法，分別對組織中RAS、MAPK和cyclinD1蛋白的表達進行檢測。
　　2、采用實時熒光定量PCR技術，檢測人食管正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組、轉移、未轉移組及浸潤程度深和淺組組織中RAS、MAPK和cyclinD1mRNA的相對表達量，評價三者的表達趨勢和相互關聯性。
　　3、以westernblot檢測人食管正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組、轉移、未轉移

10、組及浸潤程度深和淺組組織中RAS、MAPK和cyclinD1的相對表達量，評價三者的表達趨勢和相互關聯性。
　　結果：
　　1、RAS、MAPK和cyclinD1在食管鱗癌正常組織、癌旁組織、癌組織中均有不同表達，在正常組織中的陽性表達率為分別為19.0％、24.8％、26.7％，癌旁組織中的陽性表達率分別為46.7％、44.8％、50.5％，在癌組織中的陽性表達率分別為78.1％、80.9％、75.2％，癌組織組與正常組相

11、比有顯著性差異(P＜0.05)，而正常組織與癌旁組織間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織高、中、低分化組中的陽性表達P值分別為0.162、0.446、0.233，均P＞0.05，相互間比較均無顯著性差異。
　　3、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織有無淋巴結轉移組間表達的P值為0.036、0.205、0.033，表明RAS、cyclinD1在食管鱗癌

12、組織有無轉移組間比較有顯著性差異(P＜0.05)，而MAPK在食管鱗癌組織有無轉移組間比較無顯著性差異P＞0.05。
　　4、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織浸潤深和浸潤淺組間比較的P值分別為0.229、0.227、0.301，表明在食管癌細胞浸潤深淺之間無明顯差異。
　　第二部分Ras-RNAi體外阻斷RAS通路及抑制食管癌EC9706細胞系的實驗研究
　　第一章EC9706細胞中RassiRNA

13、的篩選與鑒定
　　方法：
　　1、設計三條siRNA前體片段（siK-ras-1，siK-ras-2，siK-ras-3），設計對應的shRNA片段，分別與載體psilencer2.1-u6neo相連，得到pSilencer-siK-ras-1,pSilencer-siK-ras-2,pSilencer-siK-ras-3。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定篩選出正確重組子的質粒，轉染EC9706細胞，評價干擾能力，篩選干擾效

14、率最高的片段，用于下游實驗。
　　2.轉染人食管癌EC9706細胞株，熒光顯微鏡觀察轉染的表達，確定最佳轉染效率。
　　3.轉染48h后，提取RNA，實時熒光定量PCR檢測pSilencer/siR-Ras表達載體對Ras表達水平的影響。
　　4.轉染72h后，收集細胞，Westernblot檢測pSilencer/siR-Ras表達載體對Ras表達水平的影響。
　　結果：
　　1.酶切鑒定及測序顯示pSi

15、lencer/siR-Ras表達載體構建成功;
　　2.轉染EC9706細胞48h后，轉染效率達到80％以上;
　　3.轉染48h后，提取轉染后EC9706細胞中的總RNA和總蛋白，并進行real-time和westernblot檢測，結果顯示三組細胞的ras基因表達均受到不同程度抑制，其中以pSilencer-siK-ras-2抑制最為明顯，抑制效率達到80±5％（P＜0.05）。
　　第二章Ras-RNAi抑制食管

16、癌EC9706細胞的生長并增強化療敏感性的研究
　　方法：
　　將食管癌細胞系分為六組:①細胞組（不轉染）;②陰性對照組（轉染空載體組）;③實驗組（轉染Ras-RNAi組）;④細胞加紫杉醇組;⑤陰性對照（轉染空載體組）加紫杉醇組;⑥轉染Ras-RNAi加紫杉醇組。
　　1、以MTT法檢測各實驗組細胞活性及對紫杉醇的敏感性的變化;
　　2、以流式細胞術檢測各實驗組細胞增殖指數，觀察Ras基因表達抑制后對細胞周期的影

17、響;
　　3.以TUNEL法檢測各實驗組細胞凋亡情況，觀察Ras基因表達抑制后對細胞凋亡的影響;
　　4、以免疫細胞化學法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達情況;
　　5、實時熒光定量PCR法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1表達情況，觀察Ras基因表達抑制后三種基因mRNA相對表達量的變化;
　　6、以Transwell實驗檢測各實驗組的細胞細胞遷移數，觀察體外侵襲能力的變化;<

18、br>　　7、Westernblot法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達情況，觀察RAS基因表達抑制后三種蛋白相對表達量的變化。
　　結果：
　　1、MTT檢測結果:Ras表達被抑制后，細胞生長速度明顯受抑制，實驗組相對于細胞組和陰性對照組組明顯降低(P＜0.05);紫杉醇聯合Ras-siRNA后，細胞抑制更明顯，轉染Ras-RNAi加紫杉醇組相對于細胞加紫杉醇組和陰性對照加紫杉醇組明顯降低(P＜0.05

19、)。
　　2、流式細胞術檢測結果:細胞周期亦發(fā)生了變化，共檢測了55次，處于G1/G0期的細胞比例增多，處于S或G2期的則減少，實驗組相對于細胞組和陰性對照組組更明顯(P＜0.05);轉染RASsiRNA組或加入紫杉醇后細胞阻滯于G1期，同時加入紫杉醇和Ras-siRNA后，阻滯于G1期更明顯一些（P＜0.05）。
　　3、TUNEL法檢測結果:轉染psilencer-Ras后，相對于細胞組和陰性對照組，轉染RASsiRNA

20、組及紫杉醇組凋亡增加，而轉染RASsiRNA組加入紫杉醇后細胞凋亡則更加明顯（P＜0.05），其細胞凋亡率明顯高于其他組;
　　4、Transwell實驗檢測結果:轉染psilencer-Ras后，相對于陰性對照組和細胞組，轉染RASsiRNA組或紫杉醇組的侵襲能力下降，而轉染RASsiRNA組加入紫杉醇后則下降更為明顯(P＜0.05);
　　5、細胞化學及PCR結果:相對于細胞組和陰性對照組，轉染組、陰性對照轉染組和轉染加

21、紫杉醇組中RAS、MAPK和cyclinD1蛋白的表達減少明顯(P＜0.05)，且呈遞減趨勢;而RAS基因表達抑制后，MAPK和cyclinD1mRNA的相對表達量在各組中逐漸減少，而尤以轉染加紫杉醇組中的表達最低(P＜0.05)。
　　第三部分Ras-RNAi阻斷裸鼠食管癌移植瘤Ras信號通路活性及抑制其生長的研究
　　方法：
　　1.建立人食管癌異種移植瘤實驗動物模型，進行人食管癌WC9706細胞株在裸鼠體內的成瘤

22、實驗，細胞濃度為2×107/ml，在每只鼠背部皮下注射0.2ml（細胞數為2×106/ml）。約一周后，接種部長出約米粒大小硬結，隨機分為6個實驗組:①空白cell組;②control-siRNA組;③Ras-siRNA組;④紫杉醇組;⑤Ras-siRNA+紫杉醇組，每組8只裸鼠，均采用瘤旁注射的方式，每日一次，共15次，觀察裸鼠及移植瘤的生長狀態(tài)。
　　2.以HE染色法觀察裸鼠體內人食管癌抑制瘤治療前后的組織學形態(tài)。
　　

23、3.TUNEL法檢測治療前后各組的生長抑制情況。
　　4.以免疫組織化學法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達情況，觀察裸鼠體內人食管癌移植瘤治療前后三種蛋白的表達變化。
　　5.Westernblot法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達情況，觀察觀察裸鼠體內人食管癌移植瘤治療前后三種蛋白相對表達量的變化。
　　6.實時熒光定量PCR法檢測各實驗組RAS、MAPK和cyclinD1

24、mRNA表達情況，觀察裸鼠體內人食管癌移植瘤治療前后三種基因mRNA相對表達量的變化。
　　結果：
　　1.各組裸鼠在治療前抑制瘤的體積經統(tǒng)計學分析無顯著性差異(P＞0.05)，處理后各組裸鼠抑制瘤的體積與細胞組比較明顯縮?。≒＜0.05），組織學觀察治療前細胞較大，染色較多，大小不一，異型性明顯;治療后抑制瘤細胞縮小，異型性不明顯，核染色稀疏，中心有點片狀壞死灶等，在RAS-siRNA組、紫杉醇組和RAS-siRNA+紫杉

25、醇組逐漸增大。
　　2、TUNEL法檢測結果表明:相對于細胞組，陰性對照組和RAS-siRNA組的細胞凋亡數均升高，而RAS-siRNA組的凋亡數明顯高于細胞組(P＜0.05);紫杉醇+RAS-siRNA組的凋亡數也明顯高于紫杉醇組和RAS-siRNA組（P＜0.05），但紫杉醇組與RAS-siRNA組的凋亡數比較無顯著性差異（P＜0.05）。
　　3、治療后，RAS、MAPK和cyclinD1蛋白在六組中的表達呈逐漸減少趨

26、勢，相對于細胞組和陰性對照組，轉染組的減少較明顯（P＞0.05）;在加入紫杉醇后，紫杉醇+RAS-siRNA組的表達明顯低于單純紫杉醇組和陰性對照+紫杉醇組(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、通過檢測食管癌EC9706細胞系中RAS信號通路的活性，從蛋白水平、DNA結合水平及mRNA水平等證實了食管癌中存在著RAS信號通路及RAS-siRNA對通路的阻斷作用;
　　2、食管癌組織與正常組織中RAS蛋白、MAPK蛋白

27、和cyclinD1mRNA的表達有差異，同時RAS通路的活性變化及三者的高表達與食管癌的進展、轉移、浸潤與侵襲均密切相關;
　　3、運用RNA干擾技術阻斷體內外RAS信號通路的活性，能夠降低細胞活性，使食管癌細胞的細胞周期停滯、腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖、阻止侵襲;
　　4、RAS-siRNA能使食管癌細胞中RAS通路下游基因MAPK及cyclinD1的表達顯著下降，RAS-siRNA對食管癌細胞一系列的抑制作用可能部分是通