蛋氨酸、賴氨酸及其二肽對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白α-,S1-基因表達的影響.pdf

1、本課題以泌乳奶牛乳腺組織為原材料，比較幾種不同收集乳腺上皮細胞的方法，從中選擇一種比較合適的方法，做為后續(xù)研究的基礎。在此基礎上，通過體外培養(yǎng)研究小肽和游離氨基酸以及賴氨酸和蛋氨酸比例對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白α<,Sl>基因表達的影響。 1．乳腺上皮細胞收集方法的比較研究采用三種不同的方法(酶消化、機械分離、組織塊培養(yǎng))收集乳腺上皮細胞進行體外培養(yǎng)，三種不同的方法收集的乳腺細胞連續(xù)培養(yǎng)7天，從第二天開始測MTTOD值，以此反映三

2、種方法收集的乳腺細胞在體外培養(yǎng)過程中的生長增殖情況。 結(jié)果表明：膠原酶消化收集的乳腺上皮細胞在隨后的培養(yǎng)過程中活性很低，不能正常生長和增殖。通過機械分離的方法分離乳腺組織時，分離得到的單個細胞相對較少，主要以細胞團的形式分離出來，這些細胞團形式存在的細胞，在培養(yǎng)過程中不容易貼壁，懸浮在培養(yǎng)液當中，導致其在隨后的培養(yǎng)過程中活性也很低。組織塊培養(yǎng)的方法收集的乳腺上皮細胞在培養(yǎng)過程能正常生長與增殖，并且出現(xiàn)了“拉網(wǎng)”、“圓頂狀”等上皮

3、細胞樣結(jié)構(gòu)，收集的細胞在MTI細胞增殖試驗中其OD值在培養(yǎng)5天后要顯著高于其它兩種方法收集得到的細胞(P<0.01)，而且OD值的曲線呈“S”形，符合細胞生長和增殖的規(guī)律。 2．蛋氨酸和二肽對體外培養(yǎng)酪蛋白基因表達的影響采用組織塊培養(yǎng)的方法收集奶牛乳腺上皮細胞，通過添加不同濃度的蛋氨酸，等量的蛋氨酸與蛋氨酸二肽以及蛋氨酸、賴氨酸與蛋氨酸賴氨酸二肽之間的替換，研究其對體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞酪蛋白α<,sl>基因表達的影響。蛋氨酸添

4、加水平為0、20、40、60、80和100μg/ml。結(jié)果表明：添加蛋氨酸的濃度低于60μg/ml時酪蛋白α<,sl>基因表達隨蛋氨酸濃度的增加而增強，隨后酪蛋白α<,sl>基因表達隨蛋氨酸濃度的增加而減弱，添加蛋氨酸為60μg/ml時基因表達最強，與0μg/ml組間差異顯著(P<0.05)，其余各組間差異均不顯著；用60μg/ml蛋氨酸二肽或120μg/ml蛋氨酸賴氨酸二肽替代等量的游離氨基酸時，添加二肽組乳腺上皮細胞酪蛋白α<,sl

5、>基因表達要極顯著高于添加游離氨基酸組(P<0.01)，同時變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，添加小肽組培養(yǎng)液中酪蛋白的濃度高于添加相應的游離氨基酸組。從上述結(jié)果可以說明乳腺上皮細胞可以利用蛋氨酸二肽和蛋氨酸賴氨酸二肽，而且其利用效率高于利用游離蛋氨酸的效率。為了研究影響酪蛋白α<,sl>基因表達的最佳蛋氨酸二肽添加量，在培養(yǎng)液中添加60、70、80、90、100和110μg/ml蛋氨酸二肽，培養(yǎng)結(jié)果顯示：添加蛋氨酸二肽濃度在70μg/m

6、l時酪蛋白α<,sl>基因表達到最大值，除了與添加60μg/ml組差異不顯著外與其它各濃度組間差異均顯著(P<0.05)。當?shù)鞍彼岫牡奶砑訚舛雀哂?0μg/ml，隨著添加量的增加酪蛋白基因表達反而下降，但各組間差異不顯著。表明蛋氨酸二肽與蛋氨酸一樣有一個理想的添加濃度。 3．賴氨酸與蛋氨酸比例對酪蛋白α<,sl>基因表達的影響通過體外培養(yǎng)，探討賴氨酸與蛋氨酸比例對酪蛋白α<,sl>基因表達的影響。培養(yǎng)液中賴氨酸、蛋氨酸(57μ

7、g/ml)添加比例為1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1和4.5：1(每組三個重復，5×10<'4>個/孔)，培養(yǎng)48小時后，用胰蛋白酶和EDTA消化貼壁培養(yǎng)的細胞，通過構(gòu)建的RT-PER方法檢測體外培養(yǎng)乳腺上皮細胞酪蛋白α<,sl>基因表達豐度。結(jié)果表明，當賴氨酸和蛋氨酸的比例在1：1-3.5：1時，隨著比例的升高酪蛋白α<,sl>基因表達有上升的趨勢，當比例高與3.5：1時，酪蛋白α<,sl>基因表達略

8、有下降。賴氨酸和蛋氨酸比例在1：1-2.5：1的各組與比例在3：1-4.5：1組之間酪蛋白α<,sl>基因表達差異顯著(P<0.05)，其余各組間差異均不顯著。 綜上所述：采用組織塊培養(yǎng)的方法收集的乳腺上皮細胞，在培養(yǎng)過程中能正常生長，可以用于體外培養(yǎng)研究；在體外培養(yǎng)體系中添加蛋氨酸二肽和賴氨酸蛋氨酸二肽，比添加相同含量的游離氨基酸更能促進乳腺上皮細胞酪蛋白α<,sl>基因表達；改變培養(yǎng)液中賴氨酸和蛋氨酸的比例能影響酪蛋白α<,