MiR-492調(diào)控CD147表達對結腸癌細胞LS174T奧沙利鉑耐藥性的影響的研究.pdf

1、目的:
　　結直腸癌是男性第三位、女性第二位高發(fā)的腫瘤?；熓强拱┲委煹闹匾侄?。奧沙利鉑屬含1，2二氨環(huán)己烷(DACH)的鉑類藥物，廣泛用于治療對順鉑耐藥的腫瘤。在歐洲，奧沙利鉑已被準許作為一線藥物治療結直腸癌。在目前結腸癌的化療過程中，盡管靶向抗癌治療的發(fā)展已經(jīng)取得了長足進步，對奧沙利鉑耐藥趨勢日益增加，化療藥物耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)是抗腫瘤治療的主要瓶頸。尋找有效對抗奧沙利鉑耐藥的方案已成為目前結腸癌治療的關鍵問題之一
　　已

2、研究資料表明，針對化療耐藥的靶向治療有望成為提高療效的重要策略?；诖嗽颍狙芯拷⒘藠W沙利鉑耐藥結腸癌LS174T/L-OHP細胞系，運用該細胞系開展體外實驗，可以簡化并很好的模擬結腸癌對奧沙利鉑耐藥的發(fā)展。利用此細胞系深入研究耐藥的分子機制，可能有助于發(fā)展有效治療方式，將耐藥腫瘤細胞逆轉為對化療敏感的細胞。進而發(fā)展新型靶向治療，攻克腫瘤細胞對化療耐藥的問題，這也正是目前結腸癌治療的一個熱點。
　　CD147是一個高度糖基化的

3、蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在細胞間識別中起著關鍵的作用。最近研究結果指出，CD147可能對腫瘤細胞生物學行為起著重要的調(diào)控作用，其中CD147對化療耐藥的影響提示其可能參與調(diào)節(jié)化療耐藥的機制。CD147可能成為現(xiàn)今腫瘤治療的潛在治療靶點。
　　MicroRNAs（簡稱miRNAs）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼RNA小分子。大量研究數(shù)據(jù)表明miRNAs表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)基因表達，所調(diào)控的基因涉及許多重要的細胞

4、生物學行為，如細胞增殖、凋亡、分化、遷移等，提示它們可能在腫瘤發(fā)展中扮演致瘤或抑瘤的角色，研究顯示，結腸癌細胞中miR-492可抑制細胞的增殖和侵襲能力，提示miR-492對結腸癌細胞生長起著至關重要的作用。基于這些研究，我們推測miR-492可能通過調(diào)控CD147表達，在結腸癌細胞化療耐藥過程中扮演重要角色。本研究通過開展體內(nèi)外細胞生長實驗，旨在闡明miR-492/CD147軸在結腸癌細胞奧沙利鉑耐藥中的關鍵功能調(diào)控作用。研究結果提示

5、miR-492通過調(diào)節(jié)CD147，促進結腸癌對奧沙利鉑的耐藥。CD147可能成為對抗結腸癌奧沙利鉑耐藥的一個新型治療靶點。
　　方法:
　　1.建立LS174T/L-OHP耐藥細胞系
　　本實驗所采用的方法是逐步遞增培養(yǎng)液中L-OHP濃度、間歇作用于LS174T結腸癌細胞，對其進行體外誘導篩選而獲得。應用MTT法分別檢測倍比稀釋濃度的L-OHP對其細胞的抑制率，進而確認所建立細胞系具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性。
　　

6、2.分析MiR492/CD147在結腸癌細胞LS174T及耐藥細胞LS174T/L-OHP中的表達
　　實時PCR分析LS174T/L-OHP和LS174T細胞內(nèi)miR-492和CD147的mRNA表達水平。Western blot檢測LS174T/L-OHP和LS174T細胞中CD147的表達水平。揭示miR-492/CD147可能參與結腸癌LS174T細胞對奧沙利鉑耐藥的過程。
　　3.敲低LS174T/L-OHP細胞C

7、D147表達對LS174T/L-OHP細胞耐藥性的影響
　　RNA干擾技術敲低LS174T/L-OHP細胞CD147表達后，MTT實驗結果檢測LS174T/L-OHP細胞對奧沙利鉑的耐藥性的影響。
　　4.下調(diào)LS174T/L-OHP細胞中miR492表達對CD147蛋白水平的影響
　　采用miRNA抑制體轉染LS174T/L-OHP細胞的方法，下調(diào)LS174T/L-OHP細胞中miR-492的表達對CD147蛋白水平

8、的影響。
　　5.上調(diào)LS174T/L-OHP細胞中miR-492表達對CD147蛋白水平的影響
　　轉染pre-miR-492外源性上調(diào)miR-492，檢測LS174T/L-OHP細胞中CD147蛋白含量，雙熒光素酶檢測CD1473'-UTR的啟動子熒光素酶活性，進而MTT法檢測LS174T/L-OHP細胞對奧沙利鉑的耐藥性。
　　6.體內(nèi)實驗用裸鼠腫瘤耐藥細胞，外源性上調(diào)miR-492，檢測其對CD147的調(diào)控作用

9、，同時監(jiān)測腫瘤體積來揭示miR-492/CD147對腫瘤細胞耐藥性的影響。
　　結果:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與對照組結腸癌LS174T細胞相比，奧沙利鉑耐藥細胞LS174T/L-OHP中miR-492的表達水平較低，CD147的表達水平則更高。在LS174T/L-OHP中，我們還發(fā)現(xiàn)敲低CD147可以增強LS174T/L-OHP細胞對奧沙利鉑的敏感性。采用miRNA抑制體轉染LS174T/L-OHP細胞的方法，下調(diào)LS1

10、74T/L-OHP細胞中miR-492的表達，CD147表達水平升高;外源性導入pre-miR-492上調(diào)miR-492，可以下調(diào)CD147的表達水平，同時提高腫瘤細胞對奧沙利鉑的敏感性。此外，給奧沙利鉑耐藥移植瘤注入miR-492，能夠提高耐藥細胞對藥物的響應。
　　結論:
　　1.LS174T/L-OHP耐藥細胞系的建立具有良好的耐藥性和穩(wěn)定性。
　　2.LS174T/L-OHP細胞中miR-492水平下調(diào)，CD1

11、47的蛋白和mRNA表達水平均上調(diào)。
　　3.CD147表達水平和LS174T/L-OHP細胞耐藥性相關，敲低LS174T/L-OHP細胞CD147可以增強LS174T/L-OHP細胞對奧沙利鉑的敏感性。
　　4.miR-492可以通過對CD147表達的直接調(diào)控，改變奧沙利鉑耐藥的結腸癌LS174T/L-OHP細胞對奧沙利鉑的敏感性。
　　5.動物實驗結果顯示在結腸癌細胞中，表達外源性的miR-492，可以降低細胞對奧