浙江省漢族人群耳聾相關(guān)12S rRNA和GJB2基因變異的臨床分析和功能研究.pdf

1、本課題將線(xiàn)粒體12S rRNA和GJB2基因作為切入點(diǎn)，對(duì)已經(jīng)建立的浙江省聾病資源庫(kù)進(jìn)行分析，了解非綜合征型耳聾相關(guān)基因常見(jiàn)的突變方式、臨床表現(xiàn)，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，從細(xì)胞功能學(xué)的角度對(duì)耳聾相關(guān)基因突變的分子機(jī)制進(jìn)行探討。
　　前期工作和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)
　　此部分主要介紹在已有的浙江省聾病資源霹的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行的進(jìn)一步擴(kuò)增和補(bǔ)充，目前已收集到非綜合征型耳聾病例2953例。完善已收集到的受試者和家庭成員的基本資料，

2、包括聽(tīng)力學(xué)及臨床資料，家系譜圖表等（以調(diào)查表的形式），并在他們的外周血標(biāo)本中提取DNA，并進(jìn)行線(xiàn)粒體全基因組序列測(cè)序，向受試者和家庭成員反饋基因檢測(cè)結(jié)果報(bào)告單。對(duì)有重大研究意義的家系，建立永生化類(lèi)淋巴母細(xì)胞系，并凍存和復(fù)蘇。為今后科研及臨床工作奠定良好的基礎(chǔ)，為中國(guó)聾病遺傳資源的保存做出貢獻(xiàn)，并向最終能夠?qū)崿F(xiàn)耳聾早期的診斷、干預(yù)和治療邁出扎實(shí)的一步，最終降低先天性及藥物敏感性聽(tīng)力損害的發(fā)病率。
　　第一部分221例攜帶GJB2基因

3、突變的非綜合征型耳聾先證者及家系成員基因型與聽(tīng)力損失程度的相關(guān)分析
　　目的:調(diào)查分析非綜合征型耳聾患者GJB2基因突變中基因表現(xiàn)型與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。方法:2006年4月至2012年9月期間，在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科門(mén)診篩查出221例帶有GJB2基因突變的非綜合征型耳聾先證者和家庭成員，分別根據(jù)GJB2突變對(duì)其蛋白產(chǎn)物的影響和是否攜帶235delC分類(lèi)進(jìn)行分組，并對(duì)其臨床資料進(jìn)行整理和分析。結(jié)果:與235delC復(fù)合

4、-雜合突變和非235delC突變的患者相比，含有235delC的純合突變患者出現(xiàn)更為嚴(yán)重的聽(tīng)力損失表現(xiàn);當(dāng)把GJB2基因突變分為截?cái)嗤蛔儯唇K止突變、框移突變）和非截?cái)嗤蛔儯村e(cuò)義突變）時(shí)，截?cái)嗤蛔兓颊?235delC、299delAT)的聽(tīng)力損失程度更重;G109A/-突變基因型所引起的聽(tīng)力損失程度顯著低于參照組235delC/235delC基因型（中位數(shù)PTA值為73dB，P＜0.01）。結(jié)論:本研究通過(guò)系統(tǒng)性分析證明了不同GJB2

5、基因型對(duì)聽(tīng)力損失程度的影響，并篩選出溫和基因型。同時(shí)，可以將此研究方法推廣到其他耳聾基因上，從而建立完整的耳聾基因型與臨床表型相關(guān)性分析表。此數(shù)據(jù)為日后在臨床上應(yīng)用于對(duì)GJB2基因突變相關(guān)聽(tīng)力損失患者的預(yù)后評(píng)估提供了參考依據(jù)。
　　第二部分非綜合征型聽(tīng)力損失相關(guān)的線(xiàn)粒體12s rRNA A839G基因突變的功能研究
　　目的:探討線(xiàn)粒體12s rRNA上A839G基因突變與非綜合征型聽(tīng)力損失的相關(guān)性。方法:根據(jù)臨床表現(xiàn)、線(xiàn)粒

6、體DNA全序列測(cè)序結(jié)果，尋找并確定含有線(xiàn)粒體12s rRNA A839G基因突變的先證者，并對(duì)其家系成員進(jìn)行拓展篩查，采集確診家系的外周靜脈血標(biāo)本，并將血液中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化類(lèi)淋巴母細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞倍增實(shí)驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞氧耗率實(shí)驗(yàn)、線(xiàn)粒體膜電位測(cè)試和細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)(ROS)等一系列基于細(xì)胞功能水平上的實(shí)驗(yàn)來(lái)探究A839G基因突變與非綜合征型聽(tīng)力損失的相關(guān)性。結(jié)果:線(xiàn)粒體DNA全序擴(kuò)增檢測(cè)確定含有線(xiàn)粒體1

7、2s rRNAA839G基因突變的先證者和家庭成員，進(jìn)一步的種系發(fā)生學(xué)分析發(fā)現(xiàn)839位點(diǎn)的保守性指數(shù)(CI)高達(dá)78.6％;在RPMI-半乳糖培養(yǎng)基中，含有A839G基因突變的細(xì)胞株倍增時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033);氨基糖甙類(lèi)抗生素對(duì)含有A839G基因突變細(xì)胞株的影響并不明顯;含有A839G基因突變細(xì)胞株與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出細(xì)胞氧耗率的降低，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P=0.033);與對(duì)照組相比，含有A83

8、9G基因突變細(xì)胞株ROS水平均出現(xiàn)較大幅度的升高，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P＜0.01); A839G基因突變細(xì)胞株中線(xiàn)粒體膜電位降低細(xì)胞群的數(shù)量顯著多于對(duì)照組。結(jié)論:本研究通過(guò)系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平證明了線(xiàn)粒體12s rRNA A839G基因突變對(duì)細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體呼吸鏈的功能產(chǎn)生影響，使突變的細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率明顯降低，出現(xiàn)聽(tīng)力下降的臨床表現(xiàn)。下一步的研究可以從蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)著手來(lái)進(jìn)一步探討線(xiàn)粒體12s rRNA A839G對(duì)與呼吸鏈