TRIM28在腫瘤中的表達(dá)分析及其與腫瘤相關(guān)性機(jī)制研究.pdf

1、目的:①構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒，建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)pcDNA5-TRIM28-HEK293細(xì)胞系。②探討TRIM28基因在分子水平的調(diào)控作用及其在腫瘤中的表達(dá)。③TRIM28與腫瘤相關(guān)性及機(jī)制分析。
　　方法:首先，經(jīng)PCR技術(shù)、酶切消化、測序驗證和免疫印跡雜交技術(shù)，成功構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系。其次，提取TRIM28-HEK293細(xì)胞系蛋白質(zhì)，同時設(shè)立

2、對照，通過雙向電泳，質(zhì)譜鑒定，鑒定出TRIM28調(diào)節(jié)的靶基因，并設(shè)計靶基因引物。選取DOX最佳誘導(dǎo)時間(12h)和最佳誘導(dǎo)劑量(0.1μg/ml)誘導(dǎo)可穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系，提取RNA，在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，由11對基因的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，驗證雙向電泳的結(jié)果。同時在HeLa細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM28，轉(zhuǎn)染24h后提取RNA，在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄

3、產(chǎn)物為模板，由11對基因的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步驗證雙向電泳的結(jié)果。再次，提取7種不同腫瘤細(xì)胞系RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，通過熒光定量PCR檢測TRIM28在不同腫瘤細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平。同時本實驗收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本，提取RNA，在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為

4、模板，由TRIM28和內(nèi)參（18S RNA）的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，通過熒光定量PCR檢測TRIM28在癌旁正常組織和腫瘤組織中mRNA表達(dá)水平的差異。在4T1細(xì)胞系或者HeLa細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM28，分別提取RNA及蛋白質(zhì)，通過熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測TRIM28、TWIST1與腫瘤的相關(guān)性及機(jī)制。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-

5、HEK293細(xì)胞系。將pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞系中，用潮霉素B篩選陽性克隆。經(jīng)Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了空載體的對照組Flp-InTMT-RExTM-293細(xì)胞系中，無論加DOX誘導(dǎo)還是未加DOX誘導(dǎo)，都不會檢測到TRIM28的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染了pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和pOG44質(zhì)粒的Flp-InTMT-RExTM-293細(xì)胞系中，未加DOX誘導(dǎo)的一組同

6、樣檢測不到TRIM28的表達(dá)，而在加入適量DOX誘導(dǎo)的實驗組中，TRIM28明顯有較高水平的表達(dá)。通過分析結(jié)果可以進(jìn)一步證明可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。提取可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個受TRIM28調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)基因，其中上調(diào)基因有3個、下調(diào)基因有8個。根據(jù)雙向電泳中檢測出的TRIM28調(diào)節(jié)的11個靶基因設(shè)計引物，DOX誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-H

7、EK293細(xì)胞系，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測;并在HeLa細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM28，同樣進(jìn)行熒光定量PCR檢測，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分驗證了雙向電泳的結(jié)果，TRIM28具有調(diào)控的作用，可上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達(dá)。提取7種不同腫瘤細(xì)胞系RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞系、T47D細(xì)胞系、MCF-7細(xì)胞系、MDA-MB-435細(xì)胞系及HEK293細(xì)胞系中，TRIM28 mRNA的表達(dá)水平都顯著

8、升高，這表明TRIM28 mRNA的表達(dá)與腫瘤有關(guān)。收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本，提取組織標(biāo)本RNA，通過熒光定量PCR檢測，分析熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織標(biāo)本相比，在乳腺癌腫瘤組織標(biāo)本中TRIM28 mRNA的表達(dá)水平顯著增高，約是正常組織TRIM28 mRNA表達(dá)的近4倍，這表明TRIM28的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。在具有內(nèi)源性表達(dá)TWIST1的4T1細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM28，通過兩次的Wes

9、tern blot結(jié)果本實驗均發(fā)現(xiàn)，4T1細(xì)胞系過表達(dá)TRIM28后，與只轉(zhuǎn)染了空載體的對照組相比，TWIST1的蛋白表達(dá)水平明顯升高。通過蛋白質(zhì)灰度分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TRIM28后，兩次試驗結(jié)果TWIST1蛋白水平表達(dá)都增高，分別是對照組的1.28倍和1.71倍。TWIST1是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要基因，過表達(dá)TRIM28后TWIST1表達(dá)相應(yīng)升高，表明在腫瘤中，TRIM28的表達(dá)與TWIST1的表達(dá)具有相關(guān)性，TRIM28在腫瘤發(fā)生中起到

10、重要作用可能是通過調(diào)控TWIST1來進(jìn)行的，TRIM28能夠穩(wěn)定TWIST1蛋白。為了進(jìn)一步驗證在4T1細(xì)胞系中的實驗結(jié)果，本實驗又在HeLa細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM28，通過熒光定量PCR檢測及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，TRIM28提高了HeLa細(xì)胞系中TWIST1的蛋白表達(dá)水平，mRNA水平的表達(dá)反而降低。
　　結(jié)論:成功建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系;通過雙向電泳和熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)并檢測受TR