miRNAs介導(dǎo)的EZH2調(diào)控β-catenin信號(hào)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝過程中的作用和機(jī)理.pdf

1、研究顯示Zeste基因同源物增強(qiáng)子2(enhancer ofzeste homolog2，EZH2)是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物，屬于PcG(Polycomb group)蛋白家族，為表觀遺傳蛋白調(diào)控因子PcG的核心成分之一，具有組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性。眾多研究顯示EZH2在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們的前期工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EZH2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)，提示EZH2在膠質(zhì)瘤中是潛在

2、促癌分子，但其具體功能及相關(guān)機(jī)制有待闡明。代謝調(diào)控是人體生命活動(dòng)的基本問題，其狀態(tài)異常與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?！凹?xì)胞能量異常（Deregulating Cellular Energetics）”是腫瘤細(xì)胞的特征之一。膠質(zhì)瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層，來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是具有高度異質(zhì)性的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高的特點(diǎn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)以葡萄糖為唯一能源，因此胞內(nèi)能量代謝產(chǎn)物及代謝過程的變化尤其是糖代謝異常與膠質(zhì)瘤的發(fā)生

3、發(fā)展關(guān)系密切，探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝異常的分子機(jī)制對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷治療相關(guān)研究具有重要意義。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：借助中國(guó)膠質(zhì)瘤協(xié)作組(CGGA)數(shù)據(jù)庫，分析PeG相關(guān)基因在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)情況，并在獲得的結(jié)果基礎(chǔ)上逐步細(xì)化差異表達(dá)基因與膠質(zhì)瘤組織級(jí)別的相關(guān)性，同時(shí)關(guān)注EZH2與患者生存預(yù)后的關(guān)系;隨后，分別使用RNA干擾手段和EZH2抑制劑DZNep下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的EZH2，通過細(xì)胞糖酵解水平檢測(cè)（EC

4、AR實(shí)驗(yàn)）評(píng)價(jià)EZH2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝功能的影響。結(jié)果顯示:EZH2下調(diào)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)備量均明顯降低，說明EZH2在有氧糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。β-catenin信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生演進(jìn)過程中的經(jīng)典通路之一，β-catenin已被報(bào)道與EZH2存在交互調(diào)控關(guān)系。為了驗(yàn)證這種交互機(jī)制對(duì)上述糖代謝過程的影響，我們引入β-catenin的小分子抑制劑FH535處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)β-catenin活性

5、抑制后膠質(zhì)瘤細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)備量均明顯降低，說明β-catenin能夠影響膠質(zhì)瘤代謝，這為EZH2的糖代謝調(diào)節(jié)功能提供了一個(gè)可能的效應(yīng)出口。微小RNA（microRNAs，miRNA）近10年來始終是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。miRNA的信號(hào)傳遞體系包括多種形式，其本身接受上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子信號(hào)，向下游則可通過識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA的3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region，3'-UTR)，在轉(zhuǎn)

6、錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過程而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)。隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究的開展，miRNA的研究也從單一功能走向整體綜合的水平。大量報(bào)道證實(shí)miRNA表達(dá)譜特征與腫瘤的診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后及治療效果存在相關(guān)性，是腫瘤基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要樞紐分子。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，EZH2可沉默下游諸多靶基因，而miRNA也是一大類可被EZH2調(diào)控的靶向分子。
　　第二部分：使用siRNA和DNZep兩種處理方法，分別借助miRN

7、A表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選EZH2相關(guān)miRNA差異譜。結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞使用si-EZH2處理后有204種miRNA表達(dá)上調(diào)，59種下調(diào)，而使用DNZep處理后有206種miRNA上調(diào)，22種下調(diào)，取兩者交集為EZH2相關(guān)的靶miRNA譜，獲得以miR-328、miR-1224-3p和miR-214為代表的85種呈均一趨勢(shì)顯著上調(diào)的miRNA。結(jié)合生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，我們構(gòu)建了β-catenin3'-UTR區(qū)潛在結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因

8、質(zhì)粒，雙報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證β-catenin確實(shí)為miR-328、miR-1224-3p和miR-214的直接靶基因，提示miR-328、miR-1224-3p和miR-214可介導(dǎo)EZH2對(duì)β-catenin的調(diào)控作用。之后，在CGGA數(shù)據(jù)庫同時(shí)進(jìn)行mRNA芯片和miRNA芯片檢測(cè)的膠質(zhì)瘤組織樣本數(shù)據(jù)中，我們分析發(fā)現(xiàn)EZH2與miR-328表達(dá)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與miR-1224-3p和miR-214的關(guān)聯(lián)性并不顯著。因此，我們決

9、定選擇以miR-328為例進(jìn)一步探索miRNA介導(dǎo)的EZH2作用機(jī)制。表觀遺傳學(xué)指在不改變DNA序列的前提下，通過某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型變化。近年來研究者們逐漸意識(shí)到表觀遺傳變異對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后能夠產(chǎn)生重大影響，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)異常等在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前在膠質(zhì)瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可以導(dǎo)致細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程的多種相關(guān)基因表達(dá)沉默。EZH2是多梳抑制復(fù)合

10、體2（Polycomb repressive complex，PRC2）的核心催化組分，可通過其高度保守的SET區(qū)域?qū)诵◇w組蛋白H3K27進(jìn)行甲基化。約50％的miRNA基因與CpG島有關(guān)，其可能被表觀遺傳甲基化抑制。
　　第三部分：應(yīng)用亞硫酸鹽處理后測(cè)序法檢測(cè)miR-328啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，結(jié)果顯示EZH2下調(diào)后miR-328啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯受抑，隨后結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)證實(shí)了EZH2與miR-328啟

11、動(dòng)區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證EZH2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝的影響是通過miR-328介導(dǎo)所實(shí)現(xiàn)的，我們?cè)O(shè)計(jì)了相應(yīng)的回復(fù)實(shí)驗(yàn)。在對(duì)照組和si-EZH2轉(zhuǎn)染組基礎(chǔ)上增加si-EZH2+ si-miR-328組，將si-EZH2與si-miR-328共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，EACR實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)組中ECAR比si-EZH2轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)回復(fù)效應(yīng)，且si-EZH2引起的β-catenin表達(dá)下降可被si-miR-328回復(fù)，說明si-miR-328可逆轉(zhuǎn)si