PKCα-MAPK信號(hào)激活在Tamoxifen引起C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 化學(xué)療法作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的術(shù)后輔助性治療，被認(rèn)為有助于提高患者生存率。Tamoxifen(TAM，他莫昔芬)作為抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于雌激素受體(estrogenreceptor，ER)陽性的乳腺癌的治療，近年來研究發(fā)現(xiàn)，TAM也能用于ER陰性的腫瘤化療，其中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但其作用機(jī)制并不十分清楚。 本課題應(yīng)用TAM處理大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)，觀察處理過程中PKCa、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的變

2、化，探討PKCα/MAPK信號(hào)的激活在TAM導(dǎo)致C6細(xì)胞凋亡過程中所起的作用，為臨床聯(lián)合應(yīng)用相關(guān)信號(hào)抑制劑與TAM治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法： 1.新生SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定：解剖顯微鏡下分離SD大鼠大腦皮質(zhì)，剪碎組織，0.25％胰酶消化；消化下來的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7～10d后，置于37℃恒溫?fù)u床，250rpm搖15～18h，去除脫落細(xì)胞，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90％融合時(shí)胰酶消化傳代；

3、 2.C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代，及生物學(xué)特性研究：C6細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下以含10％FBS的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，至90％融合時(shí)用胰酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為(3～5)×105/ml傳代；以細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)接種0～8d的細(xì)胞數(shù)，并繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間； 3.以免疫熒光的方法檢測C6細(xì)胞與正常大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP、Map2、Nestin及PKCCα的表達(dá)情況； 4.不同濃度TAM(10～30μ

4、M)處理靜息狀態(tài)的C6細(xì)胞(接種次日換用無血清培養(yǎng)基饑餓24h的細(xì)胞)經(jīng)不同時(shí)間點(diǎn)(0～60min)，通過WesternBlot的方法觀察細(xì)胞中PKCα、ERK、JNK等磷酸化水平的變化；通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法、DAPI染色、DNAladder、FACS等方法觀察TAM對C6細(xì)胞凋亡的影響； 5.體外培養(yǎng)的靜息狀態(tài)的C6細(xì)胞分別給予PKCα、ERK、JNK的特異性抑制劑預(yù)處理，再加入TAM，通過WesternBlot方法觀察細(xì)胞PKC

5、α、ERK、JNK等磷酸化水平的變化；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、FACS等方法同步觀察在各種不同抑制劑與TAM的共同作用下對C6細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長，胞體較大，有多條突起；經(jīng)機(jī)械振蕩純化的膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光顯示為GFAP強(qiáng)陽性，Map2和Nestin陰性，PKCα弱陽性； 2.普通培養(yǎng)條件下的C6細(xì)胞貼壁生長，胞體較小，少見雙核或多核，核漿比大，有多條細(xì)長突起；體外培養(yǎng)的C6細(xì)胞7

6、天以內(nèi)均呈對數(shù)生長，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(19.67±0.63)h；免疫熒光顯示，C6細(xì)胞GFAP陽性，不表達(dá)Map2和Nestin；與體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞比較，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PKCα強(qiáng)陽性表達(dá)，定位于胞漿和突起； 3.TAM可激活C6細(xì)胞PKCα，在30μMTAM作用時(shí)間為15min時(shí)PKCα磷酸化水平明顯升高，并隨TAM作用時(shí)間的延長而增加，一直持續(xù)至1h： 4.TAM還可激活C6細(xì)胞ERK、JNK等激酶，二者

7、的磷酸化均在TAM作用時(shí)間為15min形成峰值，隨即迅速下降，而后又稍有回升； 5.TAM可引起C6細(xì)胞死亡，與TAM濃度及作用時(shí)間正相關(guān)；SPSS軟件計(jì)算出其IC50值為(29.05±2.18)μM；TAM所致的C6細(xì)胞死亡以凋亡為主，表現(xiàn)為：①核形態(tài)的改變，熒光鏡下可觀察到核固縮，染色質(zhì)深染，聚集成團(tuán)等典型的凋亡細(xì)胞核征象；②瓊脂糖凝膠電泳可檢測出凋亡細(xì)胞特有的DNA階梯狀片段，呈TAM濃度和時(shí)間依賴性；③PI染色后經(jīng)FAC

8、S能檢測到細(xì)胞凋亡所形成的亞二倍體凋亡峰，其峰值隨TAM作用時(shí)間的延長或TAM濃度的增加而增加； 6.PKCα的特異性抑制劑Go6976能部分抑制TAM作用過程中ERK、JNK的磷酸化增加；并增強(qiáng)TAM促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡的作用：當(dāng)5，10，20，30μMTAM單獨(dú)作用時(shí)，C6細(xì)胞凋亡率分別為(4.56±3.95)％，(4.26±3.42)％；(30.03±11.00)％，(56.10±11.24)％，當(dāng)Go6976與各濃度TAM聯(lián)

9、合作用時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別升高至(28.52±7.81)％，(49.30±8.42)％，(63.53±13.65)％，(69.22±8.61)％： 7.ERK抑制劑PD98059和JNK抑制劑SP600125對于TAM所致的PKCα磷酸化水平增加并無明顯影響，但也能抑制TAM作用過程中ERK、JNK的磷酸化增加，同時(shí)增強(qiáng)TAM促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)PD98059與各濃度TAM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為(13.52±8.26)

10、％，(19.68±8.94)％，(37.66±9.40)％，(70.80±9.09)％；當(dāng)SP600125與各濃度TAM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞凋亡率分別為(12.50±8.86)％，(25.00±10.67)％，(47.78±8.92)％，(74.67±9.55)％。 結(jié)論： 1.體外傳代培養(yǎng)的大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞貼壁生長，且生長迅速；保持膠質(zhì)細(xì)胞源性，不表達(dá)具有干細(xì)胞特性的Nestin或者神經(jīng)元特性的Map2：與體外培養(yǎng)的正