糖皮質(zhì)激素增強人卵巢癌細胞對化療藥物抵抗及其機制的研究.pdf

1、卵巢癌是婦科腫瘤死亡率最高的腫瘤，因其早期癥狀不明顯，待到腫瘤發(fā)現(xiàn)時大部分已經(jīng)是晚期，而且卵巢癌易于轉(zhuǎn)移，即便是能早期發(fā)現(xiàn)行手術(shù)治療，治療后也需輔以化療，因此大部分的卵巢癌患者都需要接受化療。人工合成的糖皮質(zhì)激素(GC)如地塞米松(Dex)因其能夠減輕化療所導(dǎo)致的惡心、嘔吐以及組織水腫等毒副作用而作為化療方案中的輔助用藥常規(guī)應(yīng)用于卵巢癌的治療中。然而，近年來陸續(xù)有報道表明，GC能夠抑制多種腫瘤細胞的凋亡作用，如GC在乳腺癌、肺癌、前列腺

2、癌、宮頸癌和卵巢癌等細胞系中，能明顯抑制由化療藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡，這些化療藥物包括順鉑、紫杉醇、5-Fu、阿霉素和放線菌素D。在其他一些上皮來源的腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及神經(jīng)纖維肉瘤等細胞中這種現(xiàn)象也被證實。ZhangC等在體內(nèi)和體外實驗中均證實GC處理胰腺癌細胞將誘導(dǎo)化療耐藥。但是關(guān)于糖皮質(zhì)激素抵抗化療的具體機制目前尚不很清楚。本實驗旨在卵巢癌細胞系HO-8910和SKOV3中探討Dex是否抵抗化療藥物順鉑和紫杉醇對卵巢癌的凋亡作用以及其

3、可能的機制。本課題首先檢測了順鉑、紫杉醇兩種化療藥單獨及聯(lián)合Dex對卵巢癌HO-8910和SKOV3細胞存活的影響。結(jié)果表明，順鉑和紫杉醇單獨作用能顯著的以濃度依賴性的方式降低細胞的存活，但兩者合用存活的細胞數(shù)卻較單獨順鉑組明顯增加。
　　 本校病理生理學(xué)教研室之前的研究發(fā)現(xiàn)，用Dex處理HO-8910細胞和用無水乙醇處理細胞相比，胰酶消化細胞所需時間顯著延長。分別用100nMDex和無水乙醇處理HO-8910細胞24小時后，用

4、0.25％胰酶消化，所需的消化時間各自為16±3.5min、4±0.5min。在另一株卵巢癌細胞系SKOV3中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。說明Dex可能增強了細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附能力。為此我們進一步研究了Dex對細胞粘附能力的影響。
　　 我們用整合素β1的中和抗體來處理細胞，觀察Dex對細胞粘附能力的調(diào)節(jié)作用是否受到影響。CD44也是參與介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附作用的重要粘附分子。因此我們進一步用CD44的中和抗體來阻斷CD

5、44的信號通路，觀察Dex是否通過CD44增加HO-8910細胞與細胞外基質(zhì)的粘附。結(jié)果表明Dex是通過細胞表面粘附分子的受體增強HO-8910與細胞外基質(zhì)的粘附能力。
　　 整合素與細胞外基質(zhì)結(jié)合后，能通過激活FAK，進一步激活下游的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI-3K-AKT通路是FAK下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。既往的研究表明PI-3K-AKT活化后能保護多種細胞，如上皮細胞、成纖維細胞等免于因紫外線照射、去除培養(yǎng)液中的血清或生長因子

6、以及使貼壁培養(yǎng)的上皮細胞被懸浮等所誘導(dǎo)的細胞凋亡。因此我們首先觀察了Dex對FAK活性的影響。我們進一步檢測了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平。并使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進細胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。以上結(jié)果表明PI-3K/AKT通路介導(dǎo)了Dex對紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用。
　　 本校病理生理教研室之前的研究發(fā)現(xiàn)，Dex能明顯增強卵巢癌HO-8910細胞和SKOV3細胞與瓶壁的粘

7、附能力。這種作用與Dex上調(diào)整合素家族粘附分子的表達有關(guān)。但是Dex是否影響卵巢癌細胞ECM成分的表達和分泌還不清楚。Dex增加細胞粘附后，通過激活哪些下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)Dex抵抗化療藥誘導(dǎo)凋亡的作用也不清楚。本研究在之前研究的基礎(chǔ)上，進一步研究了Dex促進卵巢癌細胞粘附的機制和促進卵巢癌細胞在化療藥作用的存活和抗凋亡的機制。本研究不僅有助于進一步闡明GC對卵巢癌細胞增強粘附和促存活抗凋亡的作用機制，還可為臨床合理使用化療藥提供理論依

8、據(jù)。
　　 第一部分，地塞米松增強人卵巢癌細胞對化療藥物的抵抗
　　 目的：探討Dex是否抵抗化療藥物順鉑和紫杉醇對卵巢癌細胞(HO-8910、SKOV3)的凋亡作用。
　　 方法：首先用MTT法檢測了不同濃度順鉑、紫杉醇兩種化療藥物單獨及聯(lián)合Dex對卵巢癌HO-8910和SKOV3細胞存活的影響；用AnnexinV-FITC單染法，流式細胞儀檢測細胞凋亡；用Westernblotting的方法進一步檢測了活化形

9、式caspase-3蛋白的表達情況；進一步研究了Dex對卵巢癌細胞與細胞外基質(zhì)粘附能力的影響。
　　 結(jié)果：(1)順鉑單獨作用能顯著的以濃度依賴性的方式降低細胞的存活，Dex單獨作用也能抑制上述細胞的增殖，但兩者合用存活的細胞數(shù)卻較單獨順鉑組明顯增加。另外的一種用于卵巢癌治療的化療藥物紫杉醇與Dex聯(lián)用也能使HO-8910和SKOV3細胞系存活的細胞數(shù)較單用紫杉醇組明顯增多。(2)流式細胞儀檢測細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2μg/ml順鉑

10、處理HO-8910細胞，凋亡細胞數(shù)約占總細胞數(shù)的18.38％(P＜0.05)，順鉑聯(lián)合Dex處理組，其凋亡細胞數(shù)下降到總細胞數(shù)的10.1％(P＜0.01)。(3)在HO-8910細胞中，順鉑能顯著誘導(dǎo)活化的caspase-3的表達，而Dex能夠明顯抑制順鉑對活化的caspase-3表達的誘導(dǎo)作用。證明了Dex是通過抑制了化療藥物對HO-8910細胞的促凋亡作用來增強細胞的活性的。(4)Dex能夠以時間依賴的方式顯著增強HO-8910和S

11、KOV3細胞在FN包被的培養(yǎng)板中的粘附能力。
　　 結(jié)論：Dex能減輕化療藥物對卵巢癌細胞的殺傷作用。Dex是通過抑制了化療藥物對HO-8910細胞的促凋亡作用來增強細胞的活性的。Dex增強了卵巢癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力。
　　 第二部分，地塞米松增強人卵巢癌細胞對化療藥物抵抗機制的研究
　　 目的：探討地塞米松增強人卵巢癌細胞對化療藥物抵抗機制的研究。
　　 方法：設(shè)計用Dex處理不同時間點對HO-

12、8910細胞ECM成分表達與分泌的影響。100nMDex處理HO-8910細胞0～48h，realtime-PCR檢測mRNA的表達，ELISA檢測蛋白的分泌；整合素β1的中和抗體處理細胞后，用MTT法檢測了Dex促進細胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用的影響；我們用WesternBlot的方法檢測了Dex對FAK磷酸化水平的影響；進一步檢測了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平；使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進

13、細胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。
　　 結(jié)果：(1)Dex處理組細胞與對照細胞相比，Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原和層粘連蛋白mRNA的表達無明顯差別，層粘連蛋白和透明質(zhì)酸的分泌也無明顯改變。纖連蛋白mRNA的表達略上調(diào)，約為對照的1.72倍。以上結(jié)果表明在HO-8910細胞中，Dex增強細胞粘附作用可能并非通過改變細胞外基質(zhì)的成分來實現(xiàn)的。(2)整合素β1中和抗體能夠部分阻斷Dex所誘導(dǎo)的細胞與基質(zhì)問的粘附，且隨著中和抗體濃度的增高阻

14、斷作用更強。20μg/ml的整合素β1中和抗體可以使粘附的細胞數(shù)比Dex單獨處理組降低27.3％(p＜0.05)。這個結(jié)果表明整合素β1亞族介導(dǎo)了Dex對HO-8910細胞粘附能力的增強作用。(3)進一步觀察了整合素β1的中和抗體處理細胞后，Dex促進細胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用的影響，結(jié)果顯示，整合素β1中和抗體能夠降低Dex對順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用。20μg/ml的整合素β1中和抗體可以減低Dex對順鉑的保護作用，使存活的

15、細胞數(shù)為Dex單獨處理組的61.5％(p＜0.05)。(4)CD44中和抗體能夠部分阻斷Dex所誘導(dǎo)的細胞與FN之間的粘附，且隨著中和抗體濃度的增高阻斷作用更強。40μg/ml的CD44中和抗體可以使Dex處理組粘附的細胞數(shù)比單獨Dex處理組降低26.5％(p＜0.05)。(5)100nMDex處理HO-8910細胞20min，細胞中FAK的磷酸化水平即開始增高，40min時達最高峰，60min時回落至對照水平，總的FAK蛋白表達水平無

16、明顯變化，表明Dex可以快速激活FAK。在SKOV3細胞中100nMDex處理細胞10min，細胞中FAK的磷酸化水平即開始增高，60min時達最高峰。(6)100nMDex處理細胞0～36h，westernblotting結(jié)果顯示，Dex能使HO-8910和SKOV3細胞中磷酸化的AKT蛋白明顯增多，100nMDex處理HO-8910細胞8h，細胞中AKT的磷酸化水平即開始增高，12小時達高峰，持續(xù)到36小時仍然無明顯降低，總的AKT

17、蛋白表達水平無明顯變化，表明Dex可以激活A(yù)KT。相似的結(jié)果也在SKOV3細胞中得到證實。(7)使用AKT的抑制劑wortmanin觀察其是否能阻斷Dex促進細胞存活和抗化療藥誘導(dǎo)的凋亡作用。100nMDex具有保護細胞抗紫杉醇誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，使得存活細胞數(shù)較單獨紫杉醇組增加約50％，而PI-3K/AKT抑制劑wortmanin能夠逆轉(zhuǎn)Dex的此種保護作用，使得存活細胞數(shù)回到單用紫杉醇的水平
　　 結(jié)論：在HO-8910細胞