克拉霉素下調(diào)IL-32表達(dá)對COPD大鼠糖皮質(zhì)激素抵抗的影響及其機(jī)制.pdf

1、白介素-32（IL-32）最早發(fā)現(xiàn)于1992年，是 NK細(xì)胞、上皮細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子，但此后對于其研究并未取得明顯進(jìn)展，直到2005年才被正式命名為IL-32，是目前發(fā)現(xiàn)的最新的細(xì)胞因子之一。目前的研究表明IL-32在免疫缺陷癥、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩、類風(fēng)濕等疾病均有異常表達(dá)，在呼吸系統(tǒng)疾病，IL-32在肺結(jié)核、肺癌、哮喘及慢性阻塞性肺疾病（COPD）也均有異常表達(dá)。研究證明人體內(nèi)存在γ-干擾素（ INF-γ）——IL-32——白

2、介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）正反饋通路，COPD患者尤其慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）患者，該通路被激活，IL-32表達(dá)明顯增加；國內(nèi)外研究表明，硝苯地平、辛伐他汀、布地奈德等藥物能抑制哮喘中的IL-32的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用，減輕哮喘急性發(fā)作的次數(shù)及嚴(yán)重程度，國外研究還表明布地奈德也能抑制COPD中IL-32表達(dá)。國內(nèi)外的研究認(rèn)為IL-32主要通過絲裂原活化蛋白激酶P38（P38MAPK）磷酸化途

3、徑、核因子-?b（NF-?b）途徑、Caspase途徑等激活下游新號通路，上調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、白介素-8（IL-8），白介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，參與了COPD的炎癥反應(yīng)，目前研究證實(shí)INF-γ——IL-32——IL-1β通過調(diào)節(jié)TGF-β、VEGF等的表達(dá)參與COPD的氣道重塑過程及肺氣腫的形成。糖皮質(zhì)激素（GC）因?yàn)槠鋸V泛的有效的的抗炎作用，是治療 COPD最主要的藥物，但其療效遠(yuǎn)不如哮喘，目

4、前認(rèn)為導(dǎo)致這一結(jié)果原因是糖皮質(zhì)激素抵抗，早期的研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素抵抗的主要原因是GR異常所致，大量資料表明糖皮質(zhì)激素抵抗患者及動物模型均檢測到糖皮質(zhì)激素受體（GR）表達(dá)降低。而最新研究表明人體GR受體存在α、β兩種亞型，GRα是發(fā)揮糖皮質(zhì)激素效應(yīng)的靶受體，而GRβ則是一種糖皮質(zhì)激素效應(yīng)的內(nèi)源性拮抗劑，在激素抵抗型的哮喘及血液病的患者中，檢測到 GRα表達(dá)下調(diào)、GRβ表達(dá)上調(diào)，因此 GRα/GRβ失衡是糖皮質(zhì)激素抵抗的重要原因。少數(shù)研究表

5、明INF-γ——IL-32——IL-1β通過NF-?b/AP-1通路參與GRα、GRβ等表達(dá)，通過上調(diào) GRβ表達(dá)，下調(diào) GRα表達(dá)，參與了糖皮質(zhì)激素抵抗?？死顾厥且环N大環(huán)內(nèi)酯類藥物，已經(jīng)被廣泛用于穩(wěn)定期 COPD的治療，研究表明：克拉霉素可以降低穩(wěn)定期COPD患者TNF-α，IL-8，IL-6等炎癥因子的表達(dá)，抑制肺部炎癥，提高運(yùn)動耐力，改善肺功能。克拉霉素的在COPD中抗炎作用已經(jīng)被公認(rèn)，但是關(guān)于克拉霉素治療 COPD中的機(jī)制，國

6、內(nèi)外研究雖然較少，克拉霉素是否通過 INF-γ——IL-32——IL-1β通路調(diào)節(jié)下游炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮治療COPD作用，克拉霉素是否通過INF-γ——IL-32——IL-1β調(diào)節(jié)NF-?b/AP-1，影響GRα、GRβ的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗，國內(nèi)外尚未見類似研究，本研究意在探克拉霉素下調(diào)IL-32表達(dá)對COPD大鼠糖皮質(zhì)激素抵抗的影響及機(jī)制。
　　材料與方法
　　健康的雄性SD大鼠50只，體重180±20g。

7、隨機(jī)分為：空白組（10只）、模型組（40只）。模型組：第1、31、61天經(jīng)氣管插管后氣道內(nèi)滴入脂多糖，第2~30、32~60、62~90天在熏煙箱中被動吸煙。健康對照組：第1、31、61天經(jīng)氣管插管后氣道內(nèi)滴入生理鹽水，第2~30、32~60、62~90天在熏煙箱中呼吸空氣。
　　模型構(gòu)建完成后，將模型組隨機(jī)分為4組，即COPD組，克拉霉素中，布地奈德組，聯(lián)合干預(yù)組，每組10只。COPD組：第91天開始給予生理鹽水灌胃，1次/日，

8、2ml/只,共30天。克拉霉素組：第91天開始給予克拉霉素灌胃，1次/日，50mg/kg，共30天。布地奈德組：第91天開始霧化吸入布地奈德，1次/日，1mg/只，共30天。聯(lián)合干預(yù)組：第91天開始給予克拉霉素灌胃，劑量及時間同上，霧化吸入布地奈德，劑量及時間同上。第121天檢測肺功能，留取血液及肺泡灌洗液，使用ELISA法檢測血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平；部分肺組織進(jìn)行HE染色后觀察肺組織病理

9、學(xué)改變，部分肺組織使用免疫組化、Western Blot及RT-PCR檢測GRα及GRβ的表達(dá)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）描述數(shù)據(jù)，兩組間比較采用 t檢驗(yàn)，多組間比較采用采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果
　　1各組大鼠肺組織病理學(xué)改變
　　與空白組相比，COPD組大鼠氣管及支氣管粘膜上皮細(xì)

10、胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌增厚，膠原沉積，肺泡壁變薄，甚至破裂融合成肺大泡。與COPD患者的氣管及肺組織病理學(xué)變化一致。各藥物干預(yù)組的大鼠肺組織破壞程度都較COPD組輕，其中聯(lián)合干預(yù)組大鼠肺組織破壞最輕。
　　2各組大鼠肺功能改變
　　COPD組大鼠，0.3秒最大呼氣量/用力肺活量（forced expiratory volume0.3/forced vital capacity，F(xiàn)EV0.3/FVC）明顯低于空白組

11、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）、呼氣阻力（expiratory resistance， Re）明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？死顾亟M、布地奈德組FEV0.3/FVC均高于COPD組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；克拉霉素組、布地奈德組Ri及Re明顯低于COPD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合干預(yù)組FEV0.3/FVC高于CO

12、PD組、克拉霉素組及布地奈德組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合干預(yù)組Ri、Re低于COPD組、克拉霉素組及布地奈德組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平
　　COPD組血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯高于空白組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；COPD組肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明

13、顯高于空白組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。布地奈德組及克拉霉素組血清 INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；布地奈德組及克拉霉素組肺泡灌洗液明顯低于 COPD，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合

14、干預(yù)組肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明顯低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4肺組織中GRα、GRβ的免疫組化
　　COPD組GRα表達(dá)為明顯低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ表達(dá)明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。布地奈德組、克拉霉素組GRα表達(dá)均高于COPD組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ

15、表達(dá)均低于 COPD組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組 GRα表達(dá)高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ表達(dá)低于 COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5肺組織中GRα、GRβ蛋白表達(dá)水平
　　COPD組 GRα蛋白表達(dá)水明顯低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.05）；GRβ蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義（P＜0.05）。布地奈德組、克拉霉素組GRα蛋白表達(dá)水平均高于COPD組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ蛋白表達(dá)水平均低于COPD組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組GRα蛋白表達(dá)水平高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ蛋白表達(dá)水平低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6肺組織中GRα、GRβ的mRNA水平

17、
　　COPD組 GRαmRNA水平明顯低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβmRNA水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。布地奈德組、克拉霉素組GRαmRNA水平均高于COPD組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ表達(dá)均低于COPD組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合干預(yù)組GRαmRNA水平高于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GRβ表達(dá)

18、低于COPD組、布地奈德組、克拉霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7血清（B）及肺泡灌洗液中（F）INF-γ、IL-32與TNF-α、NF-kb、FEV0.3/FVC、GRα、GRβ相關(guān)性分析
　　大鼠血清及肺泡灌洗液中INF-γ與IL-32均呈正相關(guān)（P＜0.05）；大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-32與TNF-α、NF-?b均呈正相關(guān)（P＜0.05），與FEV0.3/FVC呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。大鼠血清及

19、肺泡灌洗液中IL-32、TNF-α、NF-?b與肺組織中 GRα免疫組化、蛋白表達(dá)水平、mRNA水平均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與GRβ免疫組化、蛋白表達(dá)水平、mRNA均呈正相關(guān)（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　1．INF-γ——IL-32——IL-1β正反饋環(huán)參與了COPD的發(fā)病過程，克拉霉素、布地奈德單用或聯(lián)合應(yīng)用均能不同程度抑制該反饋環(huán)激活，減輕 COPD大鼠肺部及全身的炎癥反應(yīng)，改善COPD大鼠肺功能。
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