纖毛運(yùn)送蛋白IFT25與IFT27基因分析及體內(nèi)外互作研究.pdf

1、纖毛內(nèi)運(yùn)送(IFT)是纖毛內(nèi)運(yùn)送顆粒在纖毛基部和其頂端之間進(jìn)行的雙向運(yùn)動。IFT顆粒由復(fù)合物A和B組成，分別至少含有8個和12個IFT蛋白分子。最新研究表明，纖毛是一種細(xì)胞天線，負(fù)責(zé)胞外信息向胞內(nèi)的傳遞，而IFT顆粒是纖毛生物生成和纖毛信號分子在纖毛和胞內(nèi)進(jìn)行傳遞所必需的。目前已知纖毛物理缺失或其功能缺陷會導(dǎo)致糖尿病和肥胖等多種營養(yǎng)代謝疾病的發(fā)生，這一類病因此又被統(tǒng)稱為“纖毛病”。然而，目前的現(xiàn)狀是人們對調(diào)控纖毛內(nèi)運(yùn)送的分子機(jī)制知之甚少

2、。
　　IFT25和IFT27是IFT-B復(fù)合物的小磷酸化蛋白和小G蛋白組分，由ift25和ift27編碼。
　　本研究通過對萊茵衣藻中IFT25及IFT27氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，我們得知二者在不同物種中高度保守。纖毛運(yùn)送蛋白IFT25為親水性蛋白，IFT27為疏水性蛋白，二者皆無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，屬于非分泌型胞內(nèi)蛋白。
　　在體外相互作用的研究中，以pGEX-2T，pMAL-C2H為表達(dá)載體，將目的基因25和

3、ift27分別與上述兩種載體相連構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過Western blotting檢測得到IFT25與IFT27在體外表達(dá)的關(guān)系。由實(shí)驗結(jié)果可知，IFT25單獨(dú)表達(dá)時為可溶性蛋白，IFT27單獨(dú)表達(dá)時為水不溶性蛋白，而IFT25與IFT27共表達(dá)成的融合蛋白為水溶性蛋白。
　　在體內(nèi)相互作用研究中，采用基因沉默的方法，分別使IFT25或IFT27在細(xì)胞纖毛內(nèi)的表達(dá)量降低，以FLA1

4、0為內(nèi)參，Western blotting法檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，探究其中一個表達(dá)量降低時，對另一蛋白表達(dá)量的影響。RNA水平分析發(fā)現(xiàn)，以野生型CC-125的表達(dá)量為對照，ift25基因沉默后，ift25基因的表達(dá)量降低而ift27表達(dá)量卻增高;然而ift27基因沉默后，ift27表達(dá)量降低而ift25不變。蛋白水平分析發(fā)現(xiàn)，IFT25蛋白水平降低時IFT27蛋白含量也隨之下降，而當(dāng)IFT27蛋白水平降低時IFT25含量不變。