小麥TaCBLs和TaCIPKs基因克隆與互作分析.pdf

1、Ca2+作為植物中普遍存在的第二信使，其信號(hào)傳感器類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(CBL，Calcineurin B-like protein)及其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)構(gòu)成了Ca2+-CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。CBL蛋白家族擁有四個(gè)保守性不同的EF手型結(jié)構(gòu)，每個(gè)EF結(jié)構(gòu)由12個(gè)氨基酸組成，通過(guò)loop環(huán)結(jié)合Ca2+。CIPK蛋白的

2、N端激酶區(qū)域DFG和APE結(jié)構(gòu)域之間的活性環(huán)(activation loop)，可以作為其他蛋白激酶磷酸化作用的靶位點(diǎn)。小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的的糧食作物，但是低溫、干旱、鹽漬化、高pH值和低鉀等非生物脅迫都嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，Ca2+-CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路對(duì)逆境脅迫有一定應(yīng)答作用。小麥中的Ca2+-CBL-CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究遠(yuǎn)落后于模式植物擬南芥和水稻，為了進(jìn)一步了解小麥中TaCIPK和TaCBL的分子機(jī)制和功能結(jié)構(gòu)，通過(guò)同

3、源克隆的方法克隆了TaCIPK和TaCBL家族的部分基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法分析TaCIPK基因在不同逆境脅迫條件下的組織特異性表達(dá)及時(shí)空特異性表達(dá);通過(guò)酵母雙雜交(Yeast Two-hybrid System)方法驗(yàn)證了TaCIPKs和TaCBLs之間互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用同源克隆方法，從小麥中克隆了TaCBL3、TaCBL9和TaCIPK3、

4、TaCIPK11。TaCBL3的ORF長(zhǎng)度為678bp，編碼225個(gè)氨基酸;TaCBL9的ORF長(zhǎng)度為891bp，編碼296個(gè)氨基酸;TaCIPK3的編碼區(qū)全長(zhǎng)1677bp，ORF長(zhǎng)度為1348bp，編碼447個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為50.5kD，等電點(diǎn)為8.6;TaCIPK11的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1926bp，ORF長(zhǎng)度為1524bp，包含507個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為57.5kD，等電點(diǎn)為8.75。
　　2、同源性分析表明小

5、麥TaCBL家族的基因與擬南芥、水稻、二穗短柄草、大麥等家族基因的氨基酸序列同源性都比較高。其中TaCBL9與野大麥HbCBL9、水稻OsCBL9同源性分別達(dá)到78％、74％;TaCBL3與大麥HvCBL3、玉米ZmCBL3、水稻OsCBL3的同源性分別到96％、94％、94％。功能結(jié)構(gòu)域分析表明TaCBL3和TaCBL9基因編碼的蛋白均含有3個(gè)典型的EF-hand結(jié)構(gòu)。
　　3、TaCIPK3和TaCIPK11與其他植物中CIP

6、K家族氨基酸間的同源性很高，TaCIPK3與山羊草AeCIPK31、烏拉爾圖小麥TuCIPK31、短柄草BdCIPK31的相似性分別高達(dá)100％、96％、90％;TaCIPK11與山羊草AeCIPK11、烏拉爾圖小麥TuCIPK11、短柄草BdCIPK11、大麥HvCIPK11的相似性都達(dá)到了90％以上。對(duì)TaCIPK3和TaCIPK11進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，表明小麥TaCIPK3和TaCIPK11蛋白都含有N端激酶域和C端調(diào)節(jié)域，含有蛋

7、白激酶激活環(huán)(Activation loop)和NAF/FISL基序結(jié)構(gòu)用于結(jié)合TaCBL，屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族。
　　4、在200mM NaCl(高鹽脅迫)、100μM ABA（離子脅迫）、4℃（低溫脅迫）等條件處理下對(duì)TaCIPK3和TaCIPK11的表達(dá)模式進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明:TaCIPK3在高鹽誘導(dǎo)處理下根中和葉中呈上調(diào)表達(dá);在ABA誘導(dǎo)處理下呈下調(diào)表達(dá);低溫誘導(dǎo)處理根中的TaCIPK3上調(diào)表達(dá)，而葉中Ta

8、CIPK3呈下調(diào)表達(dá)。高鹽誘導(dǎo)葉中TaCIPK11上調(diào)表達(dá)，根中TaCIPK11下調(diào)表達(dá);ABA誘導(dǎo)處理根和葉中TaCIPK11上調(diào)表達(dá);低溫誘導(dǎo)處理根中的TaCIPK11和葉中的TaCIPK11上調(diào)表達(dá)。
　　5、借助酵母雙雜交系統(tǒng)，驗(yàn)證TaCIPK3以及TaCIPK11與TaCBLs的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在酵母雙雜交系統(tǒng)中，TaCBL1/2/3/4/6/7/9連入DNA-pGBKT7載體中，構(gòu)建pGBKT7-TaCBL1/2/3/4

9、/6/7/9融合蛋白;TaCIPK3/11連入pGADT7-T載體中，構(gòu)建pGADT7-TaCIPK3/1融合蛋白。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-53×pGADT7-T、融合酵母Y187和Y2HGold(pGBKT7-TaCBL1×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL2×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL3×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL4×pGADT7-TaCIPK

10、3）以及二倍體融合酵母Y187和Y2HGold(pGBKT7-TaCBL2×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL3×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL6×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL9×pGADT7-TaCIPK11)能在選擇性固體培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA上生長(zhǎng)，并且菌落呈淡藍(lán)色，而陰性對(duì)照Y187和Y2HGold(p