類固醇受體輔激活因子SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的調(diào)控保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、造血組織對(duì)電離輻射極為敏感，是輻射損傷的主要靶器官之一。輻射射線可導(dǎo)致造血細(xì)胞大量凋亡或死亡，使細(xì)胞周期改變，細(xì)胞增殖遲緩，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重造血功能障礙。與此同時(shí)，電離輻射還可降低骨髓中基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目和分泌細(xì)胞因子的能力，進(jìn)一步阻礙輻射后造血機(jī)能的恢復(fù)。因此，盡量保護(hù)殘存造血細(xì)胞的數(shù)量、促進(jìn)照后造血細(xì)胞的增殖和維持照后造血微環(huán)境的穩(wěn)定，是治療輻射后造血損傷的有效措施。而如何同時(shí)在造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多途徑、多靶點(diǎn)的輻射后保護(hù)，是治療

2、急性放射病造血損傷時(shí)新的思考。
　　類固醇受體輔激活因子-3(steroidreceptorcoactivator-3，SRC-3)是SRC家族中重要的一員，能夠與多種核受體和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與激活多條信號(hào)通路，完成相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。SRC-3不僅能在機(jī)體中發(fā)揮了廣泛的生物學(xué)功能;更作為促瘤因子參與促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，以及對(duì)抗化療藥物引起的凋亡。已有報(bào)道證實(shí)，SRC-3在惡性血液細(xì)胞中高表達(dá)，并能發(fā)揮促增殖和對(duì)抗藥物

3、所致凋亡的作用。因此我們推斷，SRC-3可能在外因所致的造血細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用。目前，對(duì)SRC-3參與體內(nèi)造血調(diào)控的機(jī)制尚不清楚，關(guān)于在輻射所致造血損傷中的作用更是未見報(bào)道。為了驗(yàn)證SRC-3是否參與了小鼠輻射后造血損傷效應(yīng)，并探明其相關(guān)機(jī)制，我們以SRC-3基因敲除型和野生型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開展了以下實(shí)驗(yàn)。
　　我們通過海外合作的方式從美國(guó)休斯敦貝勒醫(yī)學(xué)院引進(jìn)SRC-3基因敲除小鼠的親代小鼠，并在成功繁殖和進(jìn)行基因表型鑒定后，

4、獲得一批理想的SRC-3基因敲除型和野生型實(shí)驗(yàn)用小鼠。在對(duì)所得實(shí)驗(yàn)小鼠按照不同基因型分組后，我們以60Coγ射線分別進(jìn)行了6.0Gy和4.5Gy的全身照射(totalbodyirradiation，TBI)，制造了致死劑量照后和亞致死劑量照后兩種不同的動(dòng)物輻射損傷模型。
　　為了明確SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的效應(yīng)及探討其相關(guān)機(jī)制，我們分別從體內(nèi)、體外兩方面展開實(shí)驗(yàn)。首先，我們?cè)u(píng)估了SRC-3-/-小鼠和野生型小鼠在輻

5、射后不同的造血損傷效應(yīng)，包括整體效應(yīng)，如小鼠一般情況、死亡率、體重等指標(biāo);外周血細(xì)胞、骨髓造血組織、胸腺和脾臟淋巴組織的損傷情況;并檢測(cè)了小鼠血清中造血相關(guān)細(xì)胞因子(IGF-1，IL-3，IL-6，TPO)的水平變化，驗(yàn)證了SRC-3在小鼠體內(nèi)輻射后造血損傷和造血恢復(fù)過程中均能發(fā)揮防護(hù)作用。其次，我們以小鼠細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分兩部分探討了SRC-3參與調(diào)控和保護(hù)小鼠輻射后造血損傷的機(jī)制:1）以兩種不同基因型小鼠的骨髓有核細(xì)胞(bonem

6、arrownucleatedcells，BMNCs)作為研究對(duì)象，在輻射前和輻射后各時(shí)相點(diǎn)，檢測(cè)了SRC-3對(duì)小鼠BMNCs細(xì)胞的凋亡、增殖、細(xì)胞周期、相關(guān)增殖通路的影響，以及對(duì)凋亡相關(guān)分子(NF-κB，p53，Bcl-2，Bax)和周期調(diào)控因子(cyclinA，E，D1，CDK2，CDK4，p21，p53)的調(diào)控作用，闡明了SRC-3在輻射后的小鼠BMNCs中的調(diào)控和保護(hù)作用。2）以兩種不同基因型小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarro

7、wstromalcells，BMSCs)作為研究對(duì)象，在輻射前和輻射后各時(shí)相點(diǎn)，檢測(cè)了SRC-3對(duì)小鼠BMSCs細(xì)胞的增殖活性、成纖維細(xì)胞集落形成單位(colony-formingunitoffibroblast，CFU-F)形成能力、增殖相關(guān)p-AKT蛋白表達(dá)量，和上清中VCAM-1，IGF-1，IL-3，IL-6和TPO水平的影響，明確了SRC-3在小鼠BMSCs細(xì)胞中的調(diào)控作用。所得結(jié)果總結(jié)如下:
　　主要結(jié)果:
　　

8、1.以SRC-3+/-雜合子小鼠為親代交配繁殖得到一定數(shù)目的野生型（SRC-3+/+）、雜合子（SRC-3+/-）和基因敲除的純合子(SRC-3-/-)小鼠。通過PCR和Westernblot方法分別對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因表型和蛋白表型的鑒定后，將所得SRC-3-/-小鼠SRC-3+/+小鼠分組供實(shí)驗(yàn)用。蛋白表型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRC-3-/-小鼠中SRC-3基因已經(jīng)徹底敲除，其骨髓、脾臟和胸腺組織中未測(cè)得SRC-3蛋白的表達(dá);而野生型小鼠中骨

9、髓細(xì)胞的SRC-3蛋白的表達(dá)水平顯著高于其在脾臟和胸腺中的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　2.SRC-3-/-小鼠與同齡野生型小鼠比較，具有體重輕、身材短小、發(fā)育遲緩，成年雌鼠性成熟障礙，不易受孕等特點(diǎn)。正常情況下，與野生型比較，SRC-3-/-小鼠體重和血清中IGF-1水平顯著偏低，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并且發(fā)現(xiàn)，SRC-3-/-小鼠的外周血中WBC、RBC和PLT計(jì)數(shù)和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)均略低于野生型;胸腺指數(shù)

10、、脾臟指數(shù)略高于野生型，但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.給予致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠顯現(xiàn)出更嚴(yán)重的整體損傷效應(yīng)，表現(xiàn)為一般情況更差、體重下降明顯，30天生存率更低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，提示SRC-3-/-小鼠機(jī)體抗輻射能力更弱。
　　4.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠中外周血血象更低，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和造血集落形成單位計(jì)數(shù)更少，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

11、同時(shí)骨髓病理切片提示所見輻射后SRC-3-/-小鼠的骨髓更空曠。提示SRC-3-/-小鼠輻射后顯現(xiàn)出更加嚴(yán)重的外周血和骨髓的造血損傷效應(yīng)。值得一提的是，SRC-3-/-小鼠的巨核系造血細(xì)胞在輻射后損傷尤重，在照射后11天極低點(diǎn)至隨后恢復(fù)過程中的各時(shí)相點(diǎn)，均可觀察到SRC-3-/-小鼠的外周血PLT計(jì)數(shù)、病理切片中骨髓腔巨核細(xì)胞數(shù)目和體外培養(yǎng)巨核系集落形成單位顯著低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5.給予亞致

12、死劑量TBI后，在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)可觀察到，SRC-3-/-小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均略高于野生型，并與野生型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明SRC-3-/-小鼠脾臟和胸腺的輻射后損傷程度明顯低于骨髓損傷程度，因此SRC-3-/-小鼠的淋巴組織在輻射后的損傷效應(yīng)與骨髓組織有所不同。
　　6.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠血清中IGF-1水平在照后各時(shí)相點(diǎn)持續(xù)處于較低水平，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。SRC-3-/-小

13、鼠血清中造血因子IL-3和IL-6在照后第7天顯著均低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。血清中細(xì)胞因子TPO水平則未發(fā)現(xiàn)存在組間差異。
　　7.用流式法測(cè)定兩組小鼠的BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細(xì)胞比例后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小鼠BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs中凋亡率顯著升高和Sca-1+細(xì)胞比例顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

14、0.05)。同時(shí)，用Westernblot方法測(cè)得輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中的凋亡蛋白p53和Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白NF-κB(p65)和Bcl-2表達(dá)顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后凋亡增多、殘留數(shù)目較少;其增高的凋亡敏感性與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量異常有關(guān)。
　　8.用流式法測(cè)定兩組小鼠的BMNCs的細(xì)胞周期和增殖指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小

15、鼠BMNCs的細(xì)胞周期分布和增殖指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs表現(xiàn)出G0/G1期顯著升高，S期阻滯的特點(diǎn)，同時(shí)增殖指數(shù)也顯著低于野生型(P＜0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中正性周期調(diào)控因子，包括CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4的表達(dá)水平顯著降低;負(fù)性周期調(diào)控因子p53和p21的蛋白表達(dá)量顯著升高，與野生型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。并

16、且，SRC-3-/-小鼠BMNCs中p-AKT蛋白表達(dá)量在輻射后下降，表明SRC-3-/-小鼠AKT增殖信號(hào)通路在輻射后活性降低。以上結(jié)果提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后存在細(xì)胞周期分布異常和增殖障礙的特點(diǎn)，其中周期調(diào)控因子的表達(dá)水平和的AKT信號(hào)通路活性輻射后降低，是導(dǎo)致輻射后造血恢復(fù)緩慢的重要原因。
　　9.用CKK-8法測(cè)定體外培養(yǎng)所得小鼠BMSCs的增殖活性后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠的增殖活性顯著

17、低于野生型(P＜0.05);而輻射后兩者組間差異更加顯著(P＜0.01)。并且，SRC-3-/-小鼠的CFU-F形成能力在照前和照后均顯著低于野生型，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。另外，我們還檢測(cè)了小鼠BMSCs中調(diào)控增殖的AKT信號(hào)通路活性，發(fā)現(xiàn)照前兩組小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達(dá)量水平接近;但在照后SRC-3-/-小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達(dá)量顯著低于野生型，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。以上結(jié)果說明SR

18、C-3-/-小鼠BMSCs的增殖能力和CFU-F形成能力在照射前降低，輻射后程度加重;而照射后SRC-3-/-小鼠BMSCs中AKT增殖信號(hào)通路活性降低可能是導(dǎo)致該損害加重的一個(gè)重要原因。
　　10.用ELISA法測(cè)定小鼠BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠BMSCs上清中VCAM-1和IGF-1水平偏低，與野生型比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而輻射損傷后，SRC-3-/-小鼠BM

19、SCs上清中VCAM-1、IGF-1、IL-3和IL-6水平均顯著低于野生型，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說明SRC-3-/-小鼠BMSCs分泌細(xì)胞因子的能力顯著低于野生型。
　　結(jié)論:
　　1.缺乏SRC-3可增加致死劑量TBI后小鼠死亡率，表明SRC-3可以影響輻射后小鼠的存活率，在整體水平上提高小鼠對(duì)輻射損傷的防護(hù)能力。
　　2.缺乏SRC-3可導(dǎo)致亞致死劑量TBI后，小鼠骨髓損傷更重、造血恢復(fù)更緩慢

20、。因此，SRC-3能減輕小鼠輻射后骨髓造血損傷程度，促進(jìn)造血恢復(fù)，特別是對(duì)巨核系造血影響更加明顯。
　　3.SRC-3與維持血清中IGF-1、IL-3和IL-6水平有密切關(guān)系。缺乏SRC-3可導(dǎo)致照射前后血清中的細(xì)胞因子IGF-1顯著降低，以及照射后血清中IL-3和IL-6水平嚴(yán)重不足。
　　4.SRC-3可保護(hù)輻射后小鼠BMNCs中存活的Sca-1+細(xì)胞和降低凋亡細(xì)胞，并通過激活NF-κB(p65)蛋白和抑制p53蛋白輻射

21、后的活性，降低小鼠BMNCs輻射后凋亡敏感性。
　　5.SRC-3可促進(jìn)輻射后小鼠BMNCs的增殖和周期進(jìn)程，降低G0/G1期比例，減少S期阻滯。其機(jī)制與上調(diào)正性周期調(diào)控因子CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4和下調(diào)負(fù)性周期調(diào)控因子p21和p53的表達(dá)水平，激活A(yù)KT信號(hào)通路有關(guān)。
　　6.缺乏SRC-3可導(dǎo)致正常情況下小鼠BMSCs的增殖活性、CFU-F形成能力，以及BMSCs上清中VCAM