牙齦卟啉菌重組外膜蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎性因子的差異性.pdf

1、慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是人類常見的口腔感染性疾病之一．牙周炎的發(fā)生發(fā)展受到多種因素的影響。近來研究表明，牙周炎發(fā)生是由于牙周局部免疫防御機(jī)制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖，其產(chǎn)生的多種毒力因子誘導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子或化學(xué)介質(zhì)，從而導(dǎo)致局部的細(xì)胞毒性和免疫病理變化，造成牙周組織破壞，最終導(dǎo)致牙脫落。 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)被認(rèn)為是

2、牙周疾病最重要的致病菌之一，與成年人牙周炎、青少年牙周炎、牙周膿腫、牙槽骨膿腫、牙髓感染以及難治性牙周炎都有關(guān)．牙齦卟啉單胞菌屬專性厭氧、革蘭氏陰性產(chǎn)黑色素的有菌毛桿菌。該菌具有一系列逃避宿主免疫防御機(jī)制和破壞宿主組織的毒力因子，如脂多糖(lipopolysacharides，LPS)、菌毛(fimbria)、外膜蛋白、凝結(jié)素、多糖莢膜、毒性代謝產(chǎn)物和外膜膜泡；Pg還能合成多種酶，如膠原酶、蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶

3、，但其致病機(jī)制仍未完全了解。 菌毛在細(xì)菌致病過程中的重要作用已被人們所公認(rèn)，Pg也具有能黏附牙周上皮細(xì)胞的菌毛。Hongo等(1999)發(fā)現(xiàn)，Pg外膜蛋A(Porphromonas giugivalis outermembrane protein A，PgmA)的功能與菌毛的形成有關(guān)，若該基因缺失，菌毛蛋白合成受阻。但重組PgmA(rPgmA)能否作為一個潛在的細(xì)胞激活因子，激活牙周組織中的多種靶細(xì)胞，包括免疫反應(yīng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞

4、和淋巴細(xì)胞)、具有防御作用的中性粒細(xì)胞、牙周細(xì)胞的主體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，促使其合成、分泌各種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，參與牙周組織創(chuàng)傷，尚不得知．為此有必要對此進(jìn)行進(jìn)一步的探討．該問題的闡明將有助于進(jìn)一步了解Pg在CP發(fā)病中的作用。 目的：采用重組牙齦卟啉單胞菌外膜蛋白誘導(dǎo)人口腔上皮細(xì)胞(KB細(xì)胞)、人牙齦成纖維細(xì)胞(HGF-1細(xì)胞)及人單核—巨噬樣細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)，了解它們分泌炎性細(xì)胞因子TNF—αIL

5、-1β、IL-6和IL-8的能力及其差異。 方法： 1、常規(guī)酚—氯仿法提取Pg ATCC33277基因組DNA，采用高保真PCR擴(kuò)增全長PgmA基因，T—A克隆后測定核苷酸序列。采用pET32a質(zhì)粒構(gòu)建PgmA基因原核表達(dá)載體，在E．coli BL21 DE3宿主菌中用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)目的重組蛋白rPgmA的表達(dá)，用Ni—NTA親和層析法提純rPgmA。分別用以兔抗Pg全菌血清和兔抗融合蛋白血清為一抗的Wester

6、n blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物的免疫性和抗原性。 2、用不同濃度的rPgmA刺激①KB細(xì)胞；②HGF-1細(xì)胞；③THP-1細(xì)胞三種不同細(xì)胞持續(xù)不同時間后提取上清，采用ELISA試劑盒定量檢測①TNF—α；②IL-1β；③IL-6；④IL-8四種不同細(xì)胞因子水平的變化。 結(jié)果： 1、PCR：從上述菌株基因組DNA擴(kuò)增出的PgmA目的片段大小約1475bp。 2、核苷酸和氨基酸序列分析結(jié)果：所克隆PgATCC332

7、77株P(guān)gmA基因的核苷酸序列與GeneBank中登陸的相應(yīng)的序列比較，所克隆的PgmA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別高達(dá)98.91％和99.17％． 3、SDS—PAGE結(jié)果表明，1.0、0.5、0.1、0.05mmol/LIPTG均能有效的誘導(dǎo)rPgmA的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式存在，其產(chǎn)量均約占全菌蛋白的50％。 4、Western bolt檢測結(jié)果：兔抗Pg全菌抗血清能與rPgmA結(jié)合，rPgmA免疫家兔也

8、能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。 5、rPgmA不能誘導(dǎo)KB細(xì)胞明顯增強上述細(xì)胞因子的分泌。 6、rPgmA誘導(dǎo)HGF-1細(xì)胞分泌的TNF—α和IL-1β水平呈峰形增高(P＜0.01)，TNF—α在第24小時達(dá)到峰值，IL-1β在第48小時達(dá)到峰值，但THP-1細(xì)胞在72小時內(nèi)為持續(xù)性升高(P＜0.01)。 7、rPgmA誘導(dǎo)HGF-1或THP-1細(xì)胞分泌的IL-6水平在72小時內(nèi)里持續(xù)性增強(P＜0.01)。 8、r