不同基因背景下調節(jié)性T細胞的差異性誘導及其對病毒性心肌炎發(fā)病的影響.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一類臨床常見的心血管系統(tǒng)感染性疾病。近年來在我國和歐美各國病毒性心肌炎的發(fā)病率呈上升趨勢，已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一。不僅如此，病毒性心肌炎的慢性化還可導致擴張性心肌病的發(fā)生，已經(jīng)成為心臟移植手術的重要原因之一。迄今，病毒性心肌炎的治療僅限于保守治療，并無有效的針對病因的治療，其根本原因在于其發(fā)病機制還不完全清楚。因此，闡明病毒性心肌炎的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐

2、意義。
　　 病毒感染是病毒性心肌炎的重要病因之一，其中腸道病毒尤其是B3型柯薩奇病毒(Coxsackievirus group B type 3，CVB3)感染引起的病毒性心肌炎占發(fā)病人數(shù)的一半以上。CVB3通過其受體(柯薩奇病毒-腺病毒受體，Coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)和輔助受體(Decay accelerating factor，DAF)感染心肌細胞并進行復制繁殖。在病毒性

3、心肌炎的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CVB3可以通過其編碼的Pro2A改變心肌細胞骨架或通過衣殼蛋白VF2與促凋亡蛋白Siva結合誘導心肌細胞凋亡等直接途徑引起心肌細胞的損害。但更多的研究表明病毒感染誘發(fā)的免疫反應可能是引起心肌細胞損傷的主要原因，Woodruff等人在胸腺切除小鼠或者用抗體清除T細胞后發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率和心肌炎癥程度明顯降低，首次證明了T細胞免疫應答在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用。而Opavsky MA等人進一步在CD4或CD8基因敲除小鼠

4、中發(fā)現(xiàn)心肌炎的嚴重程度在CD4敲除小鼠中明顯減弱而在CD8基因敲除小鼠中則反而加重，提示了CD4+細胞的致病作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，CVB3感染不同品系的小鼠，導致了不同程度的心肌炎癥和死亡率。同樣在流行病學調查中發(fā)現(xiàn)，CVB3感染在不同人群中導致了不同的臨床預后，大部分人感染后只表現(xiàn)為隱性感染或普通的感冒癥狀，只有少部分人進一步發(fā)展為病毒性心肌炎或慢性擴張性心肌病。探討CVB3感染不同人群或不同品系小鼠導致不同預后的原因，將有

5、助于進一步了解VMC的發(fā)病機制。因此在本研究中，我們用CVB3感染兩種不同品系的小鼠BALB/c和C57BL/6，觀察其在感染后心肌炎的發(fā)病情況同病毒感染復制的能力以及病毒感染誘發(fā)的免疫反應兩個方面之間的關系，結果顯示CVB3感染后BALB/c小鼠的心肌炎嚴重程度明顯高于C57BL/6小鼠。進一步研究發(fā)現(xiàn)CVB3本身對BALB/c和C57BL/6小鼠心肌細胞具有相似的感染能力，感染后在心肌細胞中的復制能力以及病毒蛋白的表達也無明顯差異。

6、而對免疫反應的研究發(fā)現(xiàn)，CVB3感染后BALB/c小鼠心臟局部浸潤的CD4+T細胞明顯多于C57BL/6小鼠，而CD8+T細胞的數(shù)量則沒有明顯差異，同時心臟局部和血清中TNF-α和IFN-γ等細胞因子的水平也明顯高于C57BL/6小鼠。提示了免疫反應的差異與病毒性心肌炎嚴重程度的相關性。
　　 由于調節(jié)性T細胞在維持免疫耐受以及調節(jié)機體對病毒的免疫應答中扮演了重要的角色，其數(shù)量或者功能的改變將直接影響疾病的進程。那么在病毒性心肌

7、炎的發(fā)病過程中調節(jié)性T細胞是否也起到調控免疫應答的作用?不同人群或不同品系小鼠在CVB3感染后心肌炎嚴重程度的差異是否與調節(jié)性T細胞的比例和功能的差異相關?哪些因素將影響CVB3感染后調節(jié)性T細胞的比例和功能?在本研究中我們利用BALB/c和C57BL/6小鼠對CVB3感染后病毒性心肌炎嚴重程度的差異，探討了調節(jié)性T細胞在病毒性心肌炎發(fā)病過程中的作用以及在不同基因背景下CVB3感染對調節(jié)性T細胞的誘導能力的差異及其機制。
　　

8、第一部分、BALB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎的發(fā)病情況
　　 一、BALB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎嚴重程度的差異
　　 病毒性心肌炎以病毒感染后心肌間質炎性細胞浸潤為特征，導致心肌細胞灶性壞死，纖維化，最終引起心臟功能喪失。以CVB3感染小鼠建立心肌炎動物模型，很好地模擬了臨床上病毒性心肌炎的特征，主要有血清學、病理學以及體重減輕率和死亡率等指標。以CVB3感染兩種不

9、同品系的小鼠BALB/c和C57BL/6，結果發(fā)現(xiàn)感染后第三天開始BALB/c小鼠的體重明顯下降，并呈一直下降的趨勢，到感染后第七天體重減輕率可達20％。而C57BL/6小鼠在感染后第三天有輕微減輕，但之后維持在此水平，不再進一步下降。從血清學指標來看，BALB/c小鼠在感染后第七天血清中肌酸激酶和肌酸激酶MB亞型的活性顯著性升高，肌鈣蛋白I的水平也明顯升高。而C57BL/6小鼠血清中肌酸激酶和肌酸激酶MB亞型的活性以及肌鈣蛋白I的水平

10、僅輕微升高。病理學指標是病毒性心肌炎最直觀最重要的診斷標準，CVB3感染后第七天，BALB/c小鼠的心臟外表胸側呈白色條索狀炎性滲出，石蠟切片H.E染色顯示炎性細胞的灶性浸潤和心肌細胞的片狀壞死，而C57BL/6小鼠的心臟外觀沒有明顯的條索狀炎性滲出，H.E染色顯示僅有少量的炎性細胞浸潤，沒有觀察到心肌細胞的壞死。最后，死亡率也是反應心肌炎嚴重程度的一個指標，CVB3感染BALB/c小鼠，到第七天時死亡率為75％，遠遠高于C57BL/6

11、小鼠的25％。因此，從以上結果中可以得到結論為BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎的嚴重程度明顯高于C57BL/6小鼠。
　　 二、病毒性心肌炎嚴重程度的差異與病毒易感性的關系
　　 CVB3感染心肌細胞并在其中復制繁殖，是誘發(fā)VMC的前提條件。由此我們必須排除一個可能是C57BL/6小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎嚴重程度較輕是由于CVB3不容易感染其心肌細胞，或者是在其心肌細胞中的復制能力較弱，亦或者是在其心

12、肌細胞中病毒的蛋白不能表達導致病毒不能正常包裝。因此我們首先檢測了感染早期時BALB/c和C57BL/6小鼠心臟組織中的病毒載量，結果發(fā)現(xiàn)在感染早期(感染后3天)，BALB/c和C57BL/6小鼠心臟組織的病毒載量無明顯差別。為了能更準確地反應病毒在心肌組織中的復制能力，我們還檢測了CVB3的負鏈RNA拷貝數(shù)。檢測結果發(fā)現(xiàn)，BALB/c和C57BL/6小鼠心臟組織中的CVB3負鏈RNA拷貝數(shù)在感染早期時無明顯差異。從病毒衣殼蛋白VP1的

13、表達情況來看，感染早期時兩種小鼠心臟組織中表達的VP1水平也無明顯差異。而到感染晚期時(感染后7天)，BALB/c小鼠心臟組織中病毒載量、負鏈RNA拷貝數(shù)、VP1表達都明顯高于C57BL/6小鼠。為了排除體內(nèi)復雜環(huán)境如免疫反應對病毒感染和復制的影響，我們用CVB3感染體外培養(yǎng)的兩種小鼠原代心肌細胞，在感染早期和晚期時比較其病毒載量和病毒蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)無論在感染早期還是晚期時兩種小鼠的心肌細胞中病毒載量和VP1的表達水平都基本相似。

14、
　　 綜上所述，CVB3感染后BALB/c小鼠的心肌炎嚴重程度高于C57BL/6小鼠，并且這種心肌炎嚴重程度的差異與CVB3在兩種小鼠的心肌細胞中的感染、復制和表達病毒蛋白的能力沒有明顯相關性。
　　 第二部分、BALB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后調節(jié)性T細胞的比例和功能變化
　　 一、BALB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后免疫反應的差異
　　 排除了病毒易感性差異的原因，我們進一

15、步觀察CVB3感染后兩種小鼠體內(nèi)免疫反應是否存在差異。從心臟局部的免疫反應來看，兩種小鼠感染后第七天心臟局部浸潤的單個核細胞中CD3+T細胞的數(shù)量存在明顯差異，BALB/c小鼠心臟浸潤細胞中CD3+T細胞的數(shù)量是C57BL/6的兩倍之多，進一步分析發(fā)現(xiàn)主要是CD4+T的增多，CD8+T細胞的數(shù)量在兩者心臟浸潤細胞中沒有明顯差異。體內(nèi)Brdu摻入法顯示了BALB/c小鼠心臟局部的CD4+T細胞的高增殖性，反應了BALB/c小鼠心臟局部過強

16、的細胞免疫免疫反應。心臟局部細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠心臟局部表達的TNF-α和IFN-γ水平遠高于C57BL/6小鼠。同樣從全身性的免疫反應來看，BALB/c小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的水平也明顯高于C57BL/6小鼠。因此我們看到在CVB3感染在BALB/c小鼠誘導了一個明顯強于C57BL/6小鼠的細胞免疫應答，可能是導致BALB/c小鼠心肌炎嚴重程度明顯高于C57BL/6小鼠的原因。
　　 二、BALB/c和

17、C57BL/6小鼠在CVB3感染后調節(jié)性T細胞的比例變化
　　 調節(jié)性T細胞在控制免疫反應的過度應答和維持免疫自穩(wěn)中起到及其重要的作用，因此調節(jié)性T細胞的數(shù)量和功能與免疫反應的強弱密切相關。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CVB3感染后第七天，BALB/c小鼠心臟局部T細胞的數(shù)量明顯多于C57BL/6小鼠，且分泌了更高水平的Th1型細胞因子。于是我們假設是否在CVB3感染后兩種小鼠體內(nèi)的調節(jié)性T細胞的比例或者功能存在差異，導致了免疫反應強度的

18、差異。
　　 在正常情況下，體內(nèi)的調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+)的比例很低，只占CD4+T細胞的5％-10％。在免疫應答過程中，調節(jié)性T細胞通過自身的增殖或者由效應性T細胞的轉化導致數(shù)量增加，起到控制免疫應答的作用。CVB3感染后，C57BL/6小鼠外周血中調節(jié)性T細胞的比例從第四天開始明顯升高，到感染后第七天時可達CD4+T細胞的20％左右。而BALB/c小鼠外周血中調節(jié)性T細胞的比例僅有輕度的升高，在感染后第

19、七天時遠低于C57BL/6小鼠外周血中調節(jié)性T細胞的比例。進一步檢測心臟組織浸潤細胞中調節(jié)性T細胞的比例發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠心臟浸潤細胞中調節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的比例遠遠高于在BALB/c小鼠心臟浸潤細胞中的比例。同時我們用RT-PCR的方法檢測了心臟浸潤細胞中Foxp3基因的表達情況，結果顯示C57BL/6小鼠心臟浸潤細胞中高表達Foxp3基因，而BALB/c小鼠心臟浸潤細胞表達Foxp3基因相對較弱。
　　 三、BA

20、LB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后調節(jié)性T細胞的功能比較
　　 除了調節(jié)性T細胞的比例，其抑制功能的強弱也直接影響到能否有效地控制免疫應答。因此在本研究中我們分離純化了CVB3感染后BALB/c和C57BL/6小鼠脾臟中調節(jié)性T細胞，觀察其在體外的抑制功能。結果顯示BALB/c和C57BL/6兩種小鼠的調節(jié)性T細胞的抑制功能無明顯差異，都能在體外呈數(shù)量依賴的方式有效地抑制效應性T細胞的增殖。
　　 以上結果顯示

21、C57BL/6小鼠在CVB3感染后無論是外周血還是在心臟局部調節(jié)性T細胞的比例都遠高于BALB/c小鼠，提示在CVB3感染后體內(nèi)調節(jié)性T細胞的比例與病毒性心肌炎的嚴重程度存在密切聯(lián)系。
　　 第三部分、調節(jié)性T細胞與病毒性心肌炎嚴重程度及預后的關系研究
　　 前兩部分的結果顯示BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎的嚴重程度高于C57BL/6小鼠，其原因可能是在感染后BALB/c小鼠體內(nèi)調節(jié)性T細胞的比例遠低于C5

22、7BL/6小鼠。為了直接證明調節(jié)性T細胞在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用，我們通過轉輸實驗，人為地控制調節(jié)性T細胞的比例，以此探討調節(jié)性T細胞的作用。
　　 一、轉輸調節(jié)性T細胞對BALB/c小鼠病毒性心肌炎嚴重程度的影響
　　 首先我們假設BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎嚴重程度較高是由于體內(nèi)的調節(jié)性T細胞不足以控制過強的免疫應答，那么人為增加調節(jié)性T細胞的比例是否可以起到保護作用呢?因此我們用FACS分選的方法

23、得到了較高純度的調節(jié)性T細胞(CD3+CD4+CD25high)和效應性細胞(CD3+)，以1:2的比例(Treg：Effect)轉輸?shù)紺VB3感染的BALB/c背景裸小鼠體內(nèi)(CVB3感染后三天)，觀察心肌炎的發(fā)病情況。結果發(fā)現(xiàn)只轉輸效應性細胞時，至感染后第七天小鼠發(fā)生典型的病毒性心肌炎(包括血清學指標和病理學指標)，當以調節(jié)性T細胞和效應性細胞共轉輸時則發(fā)現(xiàn)被轉輸小鼠病毒性心肌炎的癥狀明顯減輕，顯示了調節(jié)性T細胞對病毒性心肌炎的保護

24、性作用。
　　 二、去除調節(jié)性T細胞對C57BL/6小鼠病毒性心肌炎嚴重程度的影響
　　 為了進一步驗證調節(jié)性T細胞在病毒性心肌炎發(fā)病過程中的作用，我們試圖在C57BL/6小鼠中去除調節(jié)性T細胞從而觀察病毒性心肌炎的嚴重程度是否改變。因此我們同樣用FACS分選的方法從CVB3感染的C57BL/6小鼠中分離純化了去除了調節(jié)性T細胞的效應性細胞(CD3+CD4+CD25-和CD3+CD4-CD25-)并轉輸?shù)紺VB3感染的C

25、57BL/6背景裸小鼠中(CVB3感染后三天)，至感染后第七天時觀察心肌炎的發(fā)病情況。從血清學和病理學的結果發(fā)現(xiàn)，轉輸了去除調節(jié)性T細胞的效應性細胞，并不導致被轉輸小鼠病毒性心肌炎的嚴重程度升高。
　　 去除了調節(jié)性T細胞并不能使C57BL/6小鼠病毒性心肌炎的嚴重程度升高，顯然與我們的假設不符。為了解釋這個現(xiàn)象，在檢測心肌炎發(fā)病情況的同時，我們分離了C57BL/6背景裸小鼠脾臟細胞和心臟局部浸潤細胞，并用FACS分析其表型。結

26、果發(fā)現(xiàn)，脾臟細胞中有超過20％的CD4+細胞表達CD25，超過10％的CD4+細胞表達Foxp3。在心臟浸潤細胞中超過90％的CD4+細胞表達CD25，超過15％的CD4+細胞表達Foxp3。因此我們推測轉輸?shù)囊徊糠諧D4+CD25-T細胞被誘導成為CD4+CD25+Foxp3+T細胞，從而對被轉輸小鼠起到了保護性作用。
　　 以上結果顯示在BALB/c小鼠中提高調節(jié)性T細胞的比例，可以對CVB3誘導的病毒性心肌炎起到保護作用。

27、而在C57BL/6小鼠被CVB3感染后，可能誘導了CD4+CD25-效應性T細胞轉化為調節(jié)性T細胞，從而控制了病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展。
　　 第四部分、不同基因背景下調節(jié)性T細胞的差異性誘導及其機制研究
　　 以上的結果顯示，在CVB3感染的C57BL/6背景裸小鼠中轉輸了去除調節(jié)性T細胞的效應性細胞后，CD4+CD25-T細胞被誘導成為CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞，究竟是什么因素導致了CD4+CD25-T

28、細胞向調節(jié)性T細胞的轉化，值得我們進一步去研究。已有的文獻報道發(fā)現(xiàn)未成熟或半成熟狀態(tài)的樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)能夠誘導調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。因此我們檢測了CVB3感染后BALB/c和C57BL/6小鼠體內(nèi)DC細胞的成熟度變化，并分離純化了DC細胞，觀察其在體外誘導調節(jié)性T細胞的能力。
　　 一、CVB3感染的BALB/c和C57BL/6小鼠DC細胞成熟度改變
　　 成熟DC細胞能夠刺激效應性T細胞的

29、活化和增殖，起到正向調節(jié)免疫應答的作用。而未成熟的DC細胞的刺激能力明顯低于成熟DC細胞，往往誘導了效應細胞的凋亡或免疫無能狀態(tài)。近年來的文獻報道未成熟DC細胞可以誘導CD4+CD25-T細胞轉化為調節(jié)性T細胞，是其免疫負調控作用的一個重要方式。在CVB3感染后的第0、3、7天，我們分別檢測了BALB/c和C57BL/6脾臟中CD11c+DC細胞MHC-Ⅱ類分子、CD80和CD86的表達強度，結果發(fā)現(xiàn)感染后第三天BALB/c小鼠脾臟DC

30、細胞MHC-Ⅱ類分子、CD80和CD86的表達明顯增高，感染后第七天時其表達強度進一步增高。而C57BL/6小鼠在感染后DC細胞表達MHC-Ⅱ類分子、CD80和CD86的強度沒有明顯升高，維持在感染前的水平。 研究表明未成熟DC細胞可通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子誘導調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，因此我們通過FACS檢測了CVB3感染后BALB/c和C57BL/6小鼠脾臟DC細胞分泌IL-10和TGF-β的能力。結果發(fā)現(xiàn)在感染后第七天B

31、ALB/c小鼠脾臟中分泌IL-10的DC細胞比例明顯降低，而C57BL/6小鼠感染后第七天時分泌IL-10的DC細胞比例則升高至感染前的兩倍左右。同時兩種小鼠脾臟細胞中分泌TGF-β的DC細胞的比例都有一定程度升高，但兩者之間沒有明顯差異。我們進一步分離純化了CD11c+DC細胞，檢測其培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β的表達水平。結果顯示BALB/c小鼠的DC細胞在CVB3感染后其分泌IL-10的水平顯著降低，而C57BL/6小鼠的DC

32、細胞在感染后分泌IL-10的水平則明顯升高且高于BALB/c小鼠DC細胞分泌IL-10的水平。同時我們發(fā)現(xiàn)兩種小鼠的DC細胞在CVB3感染后分泌TGF-β的能力都有所上升，但兩者之間沒有明顯差異。
　　 二、未成熟DC在體外誘導調節(jié)性T細胞的能力
　　 為了進一步證實DC細胞能誘導調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，我們分離純化了CVB3感染小鼠脾臟中CD11c+DC細胞和CD4+CD25-T細胞，在體外共培養(yǎng)7天后，流式細胞術檢測Fo

33、xp3+調節(jié)性T細胞比例。結果發(fā)現(xiàn)來自CVB3感染C57BL/6小鼠的DC細胞比BALB/c小鼠來源的DC細胞具有更強的誘導調節(jié)性T細胞的能力。當在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入抗IL-10抗體后我們發(fā)現(xiàn)中和IL-10可以在很大程度上削弱C57BL/6小鼠DC細胞誘導調節(jié)性T細胞的能力，表明CVB3感染C57BL/6小鼠來源的DC細胞以部分依賴IL-10的方式誘導調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。而抗TGF-β抗體則不能明顯抑制調節(jié)性T細胞的誘導。
　　 綜

34、上所述，本研究證實了調節(jié)性T細胞在病毒性心肌炎發(fā)病過程中的保護作用，并首次發(fā)現(xiàn)BALB/c和C57BL/6小鼠在CVB3感染后其病毒性心肌炎嚴重程度的差異是由于感染后體內(nèi)不同數(shù)量的調節(jié)性T細胞而非病毒本身對心肌細胞的易感性差異導致的。進一步的研究發(fā)現(xiàn)這種調節(jié)性T細胞數(shù)量的差異是由于CVB3感染后C57BL/6小鼠體內(nèi)DC細胞不成熟狀態(tài)以及分泌IL-10的能力增加所致。本研究在一定程度上闡明了同一病原體感染時不同基因背景對調節(jié)性T細胞誘導