雄激素分泌組織構(gòu)建中的種子細(xì)胞優(yōu)化和移植后促性腺激素的調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景：
　　 由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢。因創(chuàng)傷、腫瘤等造成的睪丸缺失也常見于臨床，針對這類疾病，目前尚無滿意的治療措施。組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建雄激素分泌組織的可能，有希望為治療上述疾病提供理想的治療手段。
　　 組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織彌補(bǔ)了傳統(tǒng)睪丸假體無法同時(shí)補(bǔ)充激素的缺憾，還可避免單純細(xì)胞移植吸收過快、激素分泌功能難于

2、持久的缺點(diǎn)，但也面臨著眾多技術(shù)問題的制約。其中種子細(xì)胞來源問題一直是組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)，采用差速貼壁法能夠從不同種屬的雄性睪丸內(nèi)獲得高純度的Leydig細(xì)胞，初步地解決了工程化雄激素分泌組織研究種子細(xì)胞來源缺乏的問題。但新方法尚缺少與傳統(tǒng)方法在得率、純度和睪酮分泌能力上的定量比較，而最佳的貼壁培養(yǎng)時(shí)間也缺少得率和純度上的驗(yàn)證。其次Leydig細(xì)胞的功能調(diào)控尚需要睪丸支持細(xì)胞，在構(gòu)建中使用睪丸

3、整體消化所得細(xì)胞作為種子細(xì)胞也被證實(shí)可獲得比單純使用間質(zhì)細(xì)胞更好的結(jié)果。目前兩者的比例對于細(xì)胞移植治療和雄激素分泌組織的構(gòu)建效果具有何種影響尚不得而知。此外，差速貼壁法中間質(zhì)細(xì)胞的分離后所殘留的結(jié)構(gòu)完整的曲細(xì)精管，為進(jìn)一步分離純化Sertoli細(xì)胞提供了可能。除種子細(xì)胞問題外，前期研究中采用組織工程方法構(gòu)建出的雄激素分泌組織移植后雖能在18周內(nèi)維持較高水平的睪酮分泌能力，并在組織學(xué)上觀察到在移植物中的血管化，但未能證實(shí)其分泌能夠接受機(jī)體

4、下丘腦-垂體的調(diào)控，從而真正按照生理節(jié)律分泌睪酮，因此仍需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 研究目的：
　　 本研究擬通過比較差速貼壁法和傳統(tǒng)Percoll梯度密度離心法所獲得的兩組大鼠Leydig細(xì)胞在得率和純度上的差別，驗(yàn)證新方法的可行性，并明確差速貼壁法中不同貼壁時(shí)間對細(xì)胞得率和純度的影響;進(jìn)一步從差速貼壁法消化殘留的曲細(xì)精管中分離純化出Sertoli細(xì)胞，并驗(yàn)證其得率和純度，與LC按照不同比例共同培養(yǎng)后檢測在睪酮分泌

5、能力上的差異;通過體外構(gòu)建及去勢動物回植實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)分次消化的Leydig細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞共同作為雄激素分泌組織種子細(xì)胞的可行性，以及下丘腦-垂體-性腺軸對其分泌能力有無調(diào)節(jié)作用，為雄激素分泌組織構(gòu)建研究提供種子細(xì)胞的優(yōu)化方案和移植后的功能評估。
　　 研究方法
　　 一.差速貼壁法和梯度密度離心法分離純化大鼠LC:消化所得細(xì)胞懸液分為5組，分別接受1、2、3、12小時(shí)的貼壁培養(yǎng)和進(jìn)行梯度密度離心，所的細(xì)胞在分離即

6、刻和培養(yǎng)72后分別進(jìn)行3β-HSD流式細(xì)胞學(xué)檢測，同時(shí)行細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)鑒定和分泌功能的檢測。
　　 二.分離純化大鼠SC:在差速貼壁法分離出LC之后，對殘留的曲細(xì)精管使用分次消化法進(jìn)一步分離純化出SC，檢測得率和純度，并行細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)鑒定其特性，培養(yǎng)72小時(shí)后，與LC按照1∶1、1∶4、1∶9、0∶1四種濃度混合培養(yǎng)，檢測睪酮分泌情況。
　　 三.分步消化的LC和SC作為種子細(xì)胞構(gòu)建雄激素分泌組織:按上述方法分離純化的

7、LC和SC按照原始比例混合后接種于生物材料支架上，體外培養(yǎng)24小時(shí)候回植于大鼠腹腔，定期檢測血清睪酮和LH，與去勢鼠進(jìn)行對比。
　　 四.對受移植大鼠進(jìn)行LHRH激動劑的干預(yù):LHRH激動劑注射受移植大鼠、正常大鼠、去勢大鼠皮下，并以生理鹽水注射另一組受移植大鼠，分別檢測在短期和長期兩種干預(yù)方式下，各組大鼠在血清睪酮和LH水平上的差異，并晝夜節(jié)律對受移植大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和采血，分析血清睪酮和LH的晝夜差異。
　　 研究結(jié)果：

8、
　　 第一部分差速貼壁法和梯度密度離心法的比較
　　 2小時(shí)是差速貼壁法分離Leydig系細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)，在細(xì)胞得率[(2.04±0.26)×106個(gè)/每克睪丸]、純度[（75.2土3.1）％]和睪酮分泌能力上均優(yōu)于密度梯度離心法(P＜0.05)，該方法對Leydig干細(xì)胞有較好的保留，并且操作簡便高效，具有可重復(fù)性，適用于Leydig細(xì)胞移植治療和組織工程化雄激素分泌組織的構(gòu)建。
　　 第二部分Leydig細(xì)

9、胞和Sertoli細(xì)胞的分步消化和體外培養(yǎng)比例
　　 睪丸組織經(jīng)差速貼壁法消化后殘留的曲細(xì)精管再經(jīng)胰酶和膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶混合溶液連續(xù)消化后，SC得率(3.5±0.62)×106/每克睪丸，細(xì)胞存活率達(dá)95％以上。兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)的，LC和SC按照9∶1比例混合培養(yǎng)組的睪酮的下降速度要慢于單純的間質(zhì)細(xì)胞。
　　 第三部分促性腺激素對混合細(xì)胞構(gòu)建的雄激素分泌組織的調(diào)節(jié)
　　 分步消化得到的LC和S

10、C與支架材料都能良好地復(fù)合，所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織在3個(gè)月的觀察期內(nèi)能夠保持一定的體積和較穩(wěn)定的分泌功能，LHRH激動劑證實(shí)了組織工程技術(shù)構(gòu)建的雄激素分泌組織在體內(nèi)可接受下丘腦-垂體的上調(diào)增加分泌，所分泌的睪酮也可以對其產(chǎn)生負(fù)反饋。
　　 研究結(jié)論：
　　 本研究證實(shí)差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細(xì)胞的各級細(xì)胞成分，比percoll梯度密度離心法更便捷高效，LC的得率、純度和分泌功能均優(yōu)于后者;通