課題一：RNAi抑制USP18的表達(dá)對(duì)IFNα抗HBV效應(yīng)的體外研究課題二：干擾素刺激基因的特異性染色預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎α干擾素療效的初步研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　課題一：RNAi抑制USP18的表達(dá)對(duì)IFNα抗HBV效應(yīng)的體外研究
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是所有國(guó)家公共的衛(wèi)生問題，已有2億多人被影響。雖然從1982年就有高效的乙肝病毒疫苗，可是仍有4.0多億慢性攜帶者，而且其中75％的攜帶者在亞洲太平洋地區(qū)。慢性HBV感染導(dǎo)致的肝炎后肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等終末

2、期肝病，目前已成為危害中國(guó)人民生命健康的主要疾病。近些年來雖然有新型抗HBV藥物不斷出現(xiàn)，但是其療效不盡如人意，仍然需要探索新型的抗HBV的治療方法。α干擾素是抗HBV藥物之一，然而有相當(dāng)部分病人無應(yīng)答。這些無應(yīng)答的患者中α干擾素不敏感的機(jī)制是難以捉摸的。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中一些干擾素刺激基因的表達(dá)增加與α干擾素治療無應(yīng)答組有關(guān)。因此，深入了解RNAi抑制泛素特異性肽酶（ubiquitin s

3、pecific peptidase18，USP18）的表達(dá)以及調(diào)控具有重要的意義。
　　目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建重組USP18 RNAi慢病毒載體，并且篩選出最有顯著抑制USP18表達(dá)的重組RNAi慢病毒載體；然后轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞后觀察 HBV DNA及干擾素敏感基因15（IFN-sensitive gene，ISG15）的表達(dá)。
　　方法：在本研究中，我們?cè)隗w外化學(xué)合成針對(duì)USP18基因的三個(gè)靶點(diǎn)siRN

4、A序列（siRNA1,siRNA2,siRNA3），以慢病毒載體介導(dǎo)下構(gòu)建重組USP18 RNAi慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞5天后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)USP18 mRNA的表達(dá)水平，從中篩選抑制率最高的重組USP18 RNAi慢病毒載體；然后再轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞時(shí)加入長(zhǎng)效聚乙二醇干擾素（Pegylated interferon alfa-2a，PEG-IFNα），分五組，A組和B

5、組為重組 siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染組，C組和D組為未轉(zhuǎn)染組，E組為空白組；其中，A組和C組培養(yǎng)于含有PEG-IFNα、含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中， B組和D組培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中。即A組為PEG-IFNα+USP18-RNAi-LV1＃， B組為USP18-RNAi-LV1＃， C組為 PEG-IFNα+NC-GFP-LV， D組為NC-GFP-LV，E組為空白組），在8小時(shí)、3天、7天后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集HepG2

6、.2.15細(xì)胞的上清液檢測(cè)HBV DNA的復(fù)制，并在感染后3天收集HepG2.2.15細(xì)胞的蛋白用Western blot檢測(cè)ISG15蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：我們成功地構(gòu)建了重組USP18 RNAi慢病毒載體（即USP18-RNAi-LV1＃，USP18-RNAi-LV2＃，USP18-RNAi-LV3＃）。在重組USP18 RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞5天后，real-time PCR結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)的siR

7、NA1,siRNA2,siRNA3組重組慢病毒載體與對(duì)照組（陰性組：NC-GFP-LV，空白組）相比均有不同程度地抑制USP18 mRNA的表達(dá)，且成功篩選出最有效地抑制USP18表達(dá)的重組慢病毒載體USP18-RNAi-LV1＃﹙P＜0.05﹚。然后重組慢病毒載體USP18-RNAi-LV1＃轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，隨著時(shí)間的推移，對(duì)HBV的復(fù)制抑制作用越來越顯著，尤其A組。而Western blot結(jié)果提示A組的ISG15蛋

8、白表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果,在蛋白水平得到了進(jìn)一步驗(yàn)證抑制USP18的表達(dá)能增強(qiáng)α干擾素抗病毒的活性，具有一定的臨床意義。
　　結(jié)論：通過上述實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了USP18 RNAi重組慢病毒載體，通過抑制USP18的表達(dá)增強(qiáng)α干擾素的抗病毒作用，為慢性乙型肝炎患者的治療帶來新的希望。相信隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默USP18的表達(dá)在抗HBV方面有較大的臨床應(yīng)用前景。
　　課題二：干擾素刺激基因的特異性染

9、色預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎α干擾素療效的初步研究
　　α干擾素是目前抗乙型肝炎病毒公認(rèn)的主要藥物之一，但是只有部分患者有效。這些無效的患者中α干擾素不敏感的機(jī)制是難以捉摸的。在前期我們研究中發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中一些干擾素刺激基因的表達(dá)增加與治療無效組相關(guān)。
　　目的：我們研究慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中和正常肝組織中干擾素刺激基因ISG15和MxA的細(xì)胞特異性染色，擬從蛋白水平預(yù)測(cè)慢乙肝患者I

10、FN-α的療效。
　　方法：我們采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者α干擾素治療前的肝組織中和正常肝組織中干擾素刺激基因 ISG15和 MxA的表達(dá)，其表達(dá)形式與治療療效有關(guān)。
　　結(jié)果：慢乙肝患者IFN-α治療前肝組織中有效組ISG15和 MxA蛋白的染色主要集中MACROPHAGE內(nèi)，而無效組主要集中在肝細(xì)胞內(nèi)。在正常的肝組織中 ISG15和 MxA偶有在肝細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)論：ISG15和 MxA在慢乙肝患者