雞NLRC5基因在免疫反應(yīng)中調(diào)控機(jī)理的初步研究.pdf

1、NOD樣受體家族CARD結(jié)構(gòu)域包含分子5(NLR family, CARD domain containing5，NLRC5)在調(diào)控天然免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用，到目前為止，NLRC5已經(jīng)被證實(shí)在人和小鼠中可以調(diào)控MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)，并對(duì)NF-κB以及Ⅰ型干擾素分子通路具有抑制性調(diào)控作用。白痢沙門(mén)氏菌病是我國(guó)家禽養(yǎng)殖重要的細(xì)菌性疾病之一，該病的爆發(fā)給家禽生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。白痢沙門(mén)氏菌的隱性感染和攜帶狀態(tài)的形成會(huì)導(dǎo)致重復(fù)發(fā)病進(jìn)

2、而防治困難。白痢沙門(mén)氏菌侵入雞體內(nèi)后，會(huì)抑制MHC ClassⅠ以及誘導(dǎo)IL10表達(dá)，這一機(jī)制是阻斷清除的過(guò)程從而導(dǎo)致攜帶狀態(tài)和持續(xù)感染狀態(tài)的原因之一。雞NLRC5分子可能與沙門(mén)氏菌清除的分子機(jī)理有關(guān)。截止目前雛雞感染白痢沙門(mén)氏菌后組織水平的高通量研究尚無(wú)報(bào)道，其他菌株由于致病性和病理機(jī)制的差異僅能提供部分參考，因此有必要專(zhuān)門(mén)對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的表達(dá)譜變化進(jìn)行系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究家禽NLRC5及相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律以及

3、啟動(dòng)子缺失對(duì)NLRC5表達(dá)的影響，從而分析其受調(diào)控的可能機(jī)制，以幫助建立家禽的NLRC5調(diào)控的機(jī)制模型，更好的理解家禽白痢沙門(mén)氏菌隱性感染形成的機(jī)制以及細(xì)菌性病原清除的機(jī)理。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下。
　　1.第二章第一節(jié)，比較不同沙門(mén)氏菌菌種感染導(dǎo)致雛雞的脾臟和盲腸發(fā)生的表達(dá)譜變化。通過(guò)安捷倫雞全基因組表達(dá)譜芯片，分別對(duì)7dpi感染了白痢、腸炎還有poly(I∶C)的雛雞脾臟和盲腸進(jìn)行了表達(dá)譜分析，同時(shí)檢測(cè)IL-1α，IFNγ，IgG

4、和IgM濃度，腸道載菌量和免疫熒光鑒定脾臟載菌量。結(jié)果表明，病原刺激激發(fā)了系統(tǒng)性沙門(mén)氏菌感染的主要特征性免疫反應(yīng)。在白痢沙門(mén)氏菌感染組中，脾臟表達(dá)譜富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集于淋巴細(xì)胞的分化和增殖過(guò)程，因而呈現(xiàn)出獲得性免疫的有效激活狀態(tài);其中與Th1淋巴以及NK細(xì)胞激活有關(guān)的重要分子諸如IL15，CD28等均呈現(xiàn)下調(diào)，而與B淋巴細(xì)胞活化有關(guān)的基因例如IL7呈現(xiàn)上調(diào)。這表明細(xì)胞免疫的清除作用一定程度上已經(jīng)受到了抑制，而B(niǎo)細(xì)胞所

5、參與的抗體反應(yīng)被激活。而感染白痢沙門(mén)氏菌組的盲腸組織中，下調(diào)基因主要與天然性免疫系統(tǒng)有關(guān)，表明相關(guān)天然性免疫反應(yīng)或細(xì)胞免疫反應(yīng)活性的減弱，推測(cè)可能與抗體的保護(hù)作用增強(qiáng)有關(guān)。
　　第二章第二節(jié)，在證實(shí)白痢沙門(mén)氏菌感染過(guò)程在7dpi造成細(xì)胞免疫功能衰弱的基礎(chǔ)上，然后利用時(shí)間序列表達(dá)譜分析白痢沙門(mén)氏菌感染雛雞后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、3天、5天、7天、12天、21天脾臟組織中重要的分子事件。同時(shí)測(cè)定體重、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、

6、胸腺指數(shù)、以及IL-1α、IFNγ、IgG和IgM濃度。通過(guò)WGCNA的表型關(guān)聯(lián)分析，以及探針間的共表達(dá)特征，韋恩分析等方法挖掘?qū)е码[性感染和攜帶的差異表達(dá)基因。時(shí)序表達(dá)譜的分析初步探明了在白痢沙門(mén)氏菌感染的關(guān)鍵時(shí)期脾臟組織中表達(dá)譜發(fā)生的變化，觀察到了天然免疫到體液免疫發(fā)展變化過(guò)程中脾臟組織中重要的分子事件，包括淋巴細(xì)胞的激活，增殖和遷移事件;并鑒定出大量關(guān)鍵調(diào)控基因，例如MHC classⅠ B-F，ANXA13，IL18，BF2，T

7、NFRSF13B，BLB2以及CD28等;富集通路中的基因呈現(xiàn)兩類(lèi)高度負(fù)相關(guān)的功能團(tuán);差異表達(dá)基因中的節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)模式與脾臟指數(shù)高度正相關(guān);在不同階段中免疫反應(yīng)有關(guān)的通路表現(xiàn)出與其他信號(hào)通路和代謝通路不同的關(guān)聯(lián)特征;差異表達(dá)基因大多數(shù)均可以定位在有報(bào)道的與家禽抗體滴度有關(guān)的QTL區(qū)域內(nèi);NLRC5是差異表達(dá)基因;3dpi-5dpi是天然性免疫抑制和細(xì)胞免疫激活的關(guān)鍵階段，也是病原清除的主要時(shí)期，該階段的差異表達(dá)基因表達(dá)趨勢(shì)反應(yīng)了雛雞對(duì)

8、病原做出免疫反應(yīng)的特征;NLRC5的表達(dá)模式表明NLRC5的翻譯和激發(fā)的下游通路促進(jìn)了細(xì)胞免疫反應(yīng)和病原的清除作用，但同時(shí)可能也受到了負(fù)調(diào)控因素的調(diào)控。
　　第二章第三節(jié)，進(jìn)而基于上述試驗(yàn)提供的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，以及NLRC5對(duì)MHCI已知的調(diào)控作用的假設(shè)，開(kāi)展針對(duì)NLRC5在表達(dá)譜數(shù)據(jù)中的共表達(dá)分析，嘗試找到重要的共表達(dá)分子。共表達(dá)分析結(jié)果顯示，NLRC5與TAP1和IL21R高度共表達(dá)，其中作為MHCI區(qū)域中的分子TAP1可能在

9、受到NF-κB調(diào)控的同時(shí)也受到NLRC5的影響。
　　2.第三章第一節(jié)，鑒于NLRC5基因功能的重要性及其在雞白痢沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的表達(dá)與調(diào)控功能，本研究進(jìn)一步對(duì)雞NLRC5基因功能進(jìn)行研究。首先，克隆了雞NLRC5的全長(zhǎng)CDS以及UTR序列，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)致的生物信息學(xué)分析。在組織水平對(duì)有報(bào)道可能與NLRC5功能相關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量的檢測(cè)和分析。
　　第三章第二節(jié)，隨后基于克隆的片段構(gòu)建過(guò)表達(dá)和干擾載體，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞系

10、，并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)株。在此基礎(chǔ)上首先進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了LPS刺激，以觀察相關(guān)基因表達(dá)變化的趨勢(shì)。最后在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株上對(duì)NLRC5以及信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)模式進(jìn)行了比較和分析，并提出了NLRC5及重要相關(guān)基因的假設(shè)調(diào)控機(jī)制。NLRC5克隆和分析結(jié)果顯示，雞NLRC5與哺乳動(dòng)物NLRC5基因具有一定的同源性，推測(cè)可能和哺乳動(dòng)物該基因功能一致，可以進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，并受到表觀遺傳修飾的影響。NLRC5及其信號(hào)通路中的

11、關(guān)鍵基因在組織和細(xì)胞中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB2與NLRC5有顯著的線性共表達(dá)關(guān)系，雞的STAT1與NLRC5沒(méi)有明顯的共表達(dá)特征，推測(cè)可能對(duì)NLRC5的調(diào)控作用較復(fù)雜或可能沒(méi)有調(diào)控作用，而STAT3可能作為NF-κB2的負(fù)調(diào)控因子負(fù)反饋調(diào)控了NLRC5的表達(dá)。綜上，除MHCⅠ外，NLRC5可能調(diào)控了STAT3和IL18的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。家禽NLRC5可能具有與哺乳動(dòng)物不同的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　3.第四章，為進(jìn)一步弄清NLRC5受到調(diào)

12、控的具體過(guò)程，以及進(jìn)一步證明雞NLRC5對(duì)MHCI的調(diào)控作用，進(jìn)而幫助更好的開(kāi)展SPI-2Ⅲ型分泌系統(tǒng)對(duì)隱性感染和攜菌狀態(tài)形成作用的研究奠定基礎(chǔ)，本研究初步探索了NLRC5起始密碼子前4372bp區(qū)域不同片段的活性，并分析其潛在的可能調(diào)控原理。NLRC5的系列缺失結(jié)果證明，NLRC5可能具有2個(gè)有活性的啟動(dòng)子區(qū)域，并且通過(guò)617到1448之間的區(qū)域隔離兩個(gè)啟動(dòng)子的活性;第二個(gè)啟動(dòng)子活性要強(qiáng)于第一個(gè)啟動(dòng)子活性，并且在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了NF-κ

13、B等有報(bào)道與NLRC5表達(dá)調(diào)控有密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序，1448到4372的片段可能是脾臟組織中的發(fā)揮作用的主要啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄表達(dá)主要從2108開(kāi)始的NLRC5分子片段;下游調(diào)控可能較為復(fù)雜并且下游元件對(duì)NLRC5的表達(dá)有顯著的影響;1-2108的活性僅為1448-4372的50％左右，這表明1448-2108的活性要比1828到2108的活性低，因而推測(cè)，1828到2213的活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，甚至超過(guò)1448到4372的活性，因此

14、認(rèn)為NLRC5的核心啟動(dòng)子主要為1828到2213的片段，該區(qū)間包含的元件可能有STAT1、NF-κB、P300、MRF2、FAC1、PAX5、CREB、CPBP、NF-AT1、MRF-2、AML1、FAC1、CRX、RelA-p65。其中STAT1和NF-κB均于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前182bp起始的位置被鑒定出來(lái)。
　　未來(lái)，研究需確認(rèn)家禽NLRC5對(duì)MHCI調(diào)控的機(jī)制，通過(guò)更進(jìn)一步的ChIP，乃至ChIP-Seq對(duì)NLRC5結(jié)合啟動(dòng)