重組Dnmt1質(zhì)粒對(duì)人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞基因表達(dá)和MSI的影響.pdf

1、目的:結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生過程中存在表觀遺傳調(diào)控的異常,即存在DNA甲基化/組蛋白乙?；奈蓙y.催化DNA甲基化過程的是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt),按照酶的不同功能又分為從頭產(chǎn)生DNA甲基化的酶(Dnmt3a,Dnmt3b)和維持DNA甲基化的酶(Dnmtl).目前認(rèn)為正確維持甲基化狀態(tài)是生長(zhǎng)發(fā)育過程中所必需的,腫瘤的發(fā)生與甲基化狀態(tài)發(fā)生異常有關(guān).該研究探討了含有Dnmtl基因的真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人結(jié)腸癌SWl116細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表

2、達(dá)的影響,并且分析了錯(cuò)配修復(fù)基因甲基化對(duì)腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的影響,旨在從細(xì)胞分子水平探討DNA甲基化紊亂和結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制的關(guān)系.方法:培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系SWl116,將含有人的正義Dnmtl的真核表達(dá)載體pCMV-HMT,反義Dnmtl載體pCMV-THM及pCMV空質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入SWl116細(xì)胞,進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.通過標(biāo)記基因Neo篩選帶有外源基因的G418抗藥性克隆.分別提取轉(zhuǎn)染正、反義Dnmtl,空質(zhì)粒和未經(jīng)

3、轉(zhuǎn)染的SWl¨6細(xì)胞的DNA、RNA和總蛋白.以Western印跡實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞Dnmtl蛋白的表達(dá)情況.定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因[hMLHl、hMSH2、c-myc和p16<'INK4A>)的mRNA表達(dá).甲基化特異性PCR分析細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況.銀染法研究其對(duì)SWl116細(xì)胞MSI的影響.討論:通過基因轉(zhuǎn)染的方法研究某個(gè)基因在細(xì)胞中的作用是目前分子生物學(xué)常用的技術(shù)手段,其中脂質(zhì)體介導(dǎo)是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法