新型多發(fā)性骨性連接綜合征致病基因的定位與功能研究及三種單基因遺傳病的遺傳學分析.pdf

1、第一部分新型多發(fā)性骨性連接綜合征致病基因的定位與功能研究 多發(fā)性骨性連接綜合征(SYNS)是一類罕見的骨關(guān)節(jié)發(fā)育不全綜合征,呈常染色體顯性遺傳,表現(xiàn)為多處關(guān)節(jié)強直或融合. 多發(fā)性骨性連接綜合征存在遺傳異質(zhì)性.迄今已報道的多發(fā)性骨性連接綜合征有二種類型,均為常染色體顯性遺傳病,分別為由17號染色體的NOG 基因突變引起的SYNS1(MIM 186500)型和20號染色體的生長分化因子-5基因突變引起的SYNS2(MIM 6

2、10017)型. 本研究報道的家系來自青海省一個由五代共58人組成的SYNS大家系,呈顯性遺傳,具有與以往國內(nèi)外報道相同的臨床表型.本研究對這一SYNS大家系進行了候選基因連鎖分析和測序分析,排除了由.NOG基因和GDF5基因致病的可能性,為此提出SYNS存在第三種遺傳異質(zhì)性,并命名為SYNS3型.經(jīng)全基因組掃描和單倍型分析,將致病基因定位在13q11-q12,并通過精細定位將范圍縮小至D13S175-D13S221之間(約8.

3、6 Mb).其中D13S1236的LOD值最高,為3.70(θ=0.0).這一范圍包括22個己知的候選基因.通過文獻檢索候選基因的功能,發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子9(fibroblast growchfactor 9,FGF9)參與骨發(fā)育過程.對家系成員的FGF9基因進行突變檢測,在所有病人中發(fā)現(xiàn)了該基因的突變,而在正常家系成員中未發(fā)現(xiàn).在100個無血緣關(guān)系的人群中也未發(fā)現(xiàn)FGF9基因突變.因此,這一家系的SYNS是由FGF9基因突變導致.

4、這是首次在人類中發(fā)現(xiàn)該基因突變,也是第一次發(fā)現(xiàn)FGF9是第三個與SYNS有關(guān)的基因. FGF9基因是成纖維細胞生長因子家族的成員之一,共有3個外顯子組成,產(chǎn)生一種含208個氨基酸的分泌性糖蛋白.突變發(fā)生在FGF9蛋白的一個保守的氨基酸基序上(EFISIA),該基序?qū)GF9蛋白的分泌及與受體結(jié)合具有重要作用.在COS-7細胞中轉(zhuǎn)染正常及突變FGF9 cDNA,培養(yǎng)上清中檢測到突變FGF9蛋白的表達,證實突變并未阻礙FGF9蛋白的

5、分泌.蛋白質(zhì)三維模擬(Molscriptprogram)顯示,突變后的FGF9蛋白與其受體FGFR3IIIc的結(jié)合更為緊密.用正常及突變FGF9作用大鼠顱骨問充質(zhì)細胞株RCJ3.1C5.18(軟骨細胞前體)和新生小鼠肋軟骨細胞,顯示在軟骨增殖階段,突變FGF9促進軟骨的增殖能力弱于正常FGF9.阿利辛蘭(Alcian Blue)染色也證實,突變FGF9作用的軟骨細胞的染色低于正常對照.這些結(jié)果提示FGF9的突變可能減少了成熟軟骨細胞的數(shù)

6、量.檢測小鼠關(guān)節(jié)FGF9的表達,顯示FGF9在生長板的增殖區(qū)和'肥大區(qū)軟骨中表達.因此,突變FGF9可能通過影響軟骨細胞的增殖及終末分化,進而影響了軟骨內(nèi)骨化的過程,最終導致骨關(guān)節(jié)融合.為進一步研究FGF9在SYNS3型發(fā)生中的作用,本研究建立了在軟骨組織中特異性表達正常及突變FGF9 cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠,為在體研究提供實驗模型. 第二部分三種單基因遺傳病的遺傳學分析 一、COLlA1基因-新的剪接突變導致I型成骨不全

7、成骨不全(Osteogenesis imperfecta,OI)是一種常染色體顯性遺傳病,以骨脆性增加及結(jié)締組織異常為特點.90﹪的病人是由編碼I型膠原鏈的COLlA1和COLlA2基因突變所引起的,兩個基因分別由51個和52個外顯子組成.本研究對國內(nèi)一個成骨不全家系進行基因突變檢測及突變效應分析,為研究中國人群成骨不全基因突變的特點提供線索.通過對成骨不全I型膠原基因COLlA1和COLlA2所在的17號染色體和7號染色體分別進行連鎖

8、分析,對致病基因做初步判斷.由于OI基因突變位點與臨床表型有一定相關(guān),根據(jù)家系病人臨床表現(xiàn)選擇部分致病基因外顯子進行初步突變篩選.發(fā)現(xiàn)該家系所有患者在COL1A1基因的第8個內(nèi)含子剪切受體位點處發(fā)生AG→GG(IVS8-2A>G).對比人類Ⅰ型和Ⅲ型膠原突變數(shù)據(jù)庫(Human Type and Type CollagenMutations Database) 和人類基因組突變數(shù)據(jù)庫 (Human GenomeMutations Data

9、base),以及文獻檢索未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該突變的報道.本研究結(jié)合病人臨床表型,首先選取部分外顯子進行突變篩查,這種策略為OI的致病基因突變篩查提供了一個新的思路.表現(xiàn)型與突變類型的相關(guān)性研究,對產(chǎn)前診斷及基因治療具有一定參考價值. 二、Ⅰ型糖原累積癥-家系的分子遺傳學分析Ⅰ型糖原累積癥(GSD Ia；MIM 232200)是常染色體隱性遺傳病,是由葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)缺陷引起.

10、目前已有80多種突變類型被報道.不同種族有不同的突變熱點,G6Pase基因第5外顯子是突變高發(fā)區(qū)域.本研究在一個GSD Ia家系發(fā)現(xiàn)一新的突變.提取病人及其父母和家系中其他正常人的外周血基因組DNA,擴增G6Pase基因編碼區(qū),并直接測序.結(jié)果顯示病人為第5外顯子發(fā)生復合性突變,第727位核苷酸發(fā)生G>T顛換(727G>T),同時第1071位核苷酸發(fā)生C>A顛換,使第331位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?A331E).第5外顯子727 G

11、>T是中國人中常見的突變類型,而A331E突變?yōu)槭状螆蟮?這一復合基因突變的發(fā)現(xiàn)豐富了中國人G6Pase基因突變譜,并又一次證實中國人的突變熱點區(qū)域在第5外顯子,為縮小G6Pase基因突變篩查范圍提供了依據(jù). 三、老年高膽固醇血癥人群中PCSK9基因序列變異的研究高膽固醇血癥是常見的復雜性疾病,其中一部分是由單基因突變所致,而大多數(shù)是多個基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果.本研究使用:PCR產(chǎn)物測序方法,對PCSK9基因外顯子、外顯子