角倍蚜唾液蛋白的研究.pdf

1、蚜蟲以特殊的刺吸式口器取食植物汁液，是重要的農(nóng)林業(yè)害蟲，但也有一些種類如五倍子蚜可以在鹽膚木屬(Rhus)植物上形成蟲癭（五倍子），是重要的資源昆蟲。蚜蟲唾液是蚜蟲與植物相互作用的媒介，在蚜蟲與寄主植物的互作中起著至關(guān)重要的作用，唾液腺是分泌唾液的器官。研究蚜蟲唾液及唾液腺中的蛋白成分，將有助于揭示蚜蟲-植物互作的機(jī)制，為控制有害種類的為害和有益種類的利用提供科學(xué)依據(jù)。本文主要以五倍子蚜的主要生產(chǎn)種——角倍蚜(Schlechtendal

2、ia chinensis(Bell))干雌為研究對(duì)象，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別對(duì)唾液和唾液腺蛋白進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。對(duì)用Parafilm雙層膜夾營養(yǎng)液法收集到的角倍蚜干雌唾液運(yùn)用超濾膜濃縮法進(jìn)行濃縮富集，對(duì)解剖得到的角倍蚜干雌唾液腺運(yùn)用超聲破碎輔助裂解液裂解的方法進(jìn)行提取蛋白，對(duì)收集、提取到的唾液及唾液腺蛋白進(jìn)行Bradford法定量檢測(cè)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)得到的數(shù)

3、據(jù)運(yùn)用Mascot軟件比對(duì)豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)蛋白數(shù)據(jù)庫V2.1b進(jìn)行檢索，分析蟲癭內(nèi)角倍蚜干雌唾液和唾液腺的蛋白種類和組成，為深入分析角倍蚜與寄主植物的互作關(guān)系及蟲癭形成過程提供依據(jù)。主要結(jié)論如下:
　　(1)角倍蚜干雌唾液蛋白提取方法
　　采用雙層膜夾營養(yǎng)液方法，收集角倍蚜干雌唾液，分別采用沉淀劑沉淀、真空冷凍干燥和超濾膜離心三種方進(jìn)行濃縮，根據(jù)Bradford法蛋白定量、SDS-PAGE和LC

4、-MS/MS3種檢測(cè)方法的綜合結(jié)果對(duì)3種濃縮方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:超濾膜法濃縮得到的唾液蛋白在3種檢測(cè)方法中的濃度、分離和分析效果均高于其他兩種，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用此方法對(duì)角倍蚜干雌唾液進(jìn)行濃縮。
　　(2)角倍蚜干雌唾液腺蛋白收集方法
　　利用解剖顯微鏡，通過對(duì)大量角倍蚜干雌的解剖，對(duì)解剖角倍蚜干雌的方法進(jìn)行了優(yōu)化，能夠快速、準(zhǔn)確解剖和收集唾液腺。采用超聲破碎輔助裂解液處理唾液腺，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)、Bradford法

5、蛋白定量、SDS-PAGE和LC-MS/MS方法對(duì)唾液腺蛋白進(jìn)行定量和分離，成功提取到了唾液腺蛋白。
　　(3)角倍蚜干雌唾液和唾液腺蛋白鑒定
　　對(duì)通過LC-MS/MS檢測(cè)得到的唾液和唾液腺肽段數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)法方法進(jìn)行分析，從而對(duì)唾液和唾液腺蛋白進(jìn)行鑒定和分類。通過與豌豆蚜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，角倍蚜干雌唾液腺鑒定出有141個(gè)蛋白，唾液鑒定出有31個(gè)蛋白，其中唾液和唾液腺有17個(gè)共有蛋白。其中包含了主要的唾液蛋白，表明這兩

6、種方法均可以有效提取和鑒定角倍蚜唾液蛋白，其分析結(jié)果可以互相印證。
　　(4)角倍蚜干雌唾液蛋白分析
　　對(duì)角倍蚜與另外3種非致癭蚜的唾液蛋白進(jìn)行比較，有1類為共有蛋白，即氧化還原酶類，表明這類蛋白是唾液的基本功能蛋白，對(duì)致癭蚜和非致癭蚜均是如此。共有蛋白的存在還表明目前的唾液提取和分析方法具有較好的穩(wěn)定性。角倍蚜唾液中還具有2類特異的結(jié)合蛋白，且在唾液蛋白中占有很高的比例，因?yàn)槠渌?種非致癭蚜唾液中均沒有鑒定出結(jié)合蛋白，因

7、此推測(cè)這些結(jié)合蛋白可能與蟲癭的形成有關(guān)，是今后蟲癭形成機(jī)理研究的重點(diǎn)。
　　(5)角倍蚜干雌唾液腺蛋白分析
　　角倍蚜和豌豆蚜唾液腺蛋白中具有6個(gè)共有蛋白，表明本實(shí)驗(yàn)方法具有較好的穩(wěn)定性。在141個(gè)角倍蚜唾液腺蛋白中，其中有功能注釋的105個(gè)，以結(jié)合蛋白的比例最高，與唾液蛋白分析的結(jié)果一致。角倍蚜唾液腺中有4類特異存在的蛋白，且在唾液腺蛋白中占有很高的比例，在非致癭蚜-豌豆蚜的唾液腺分泌蛋白中沒有鑒定出，推測(cè)這些蛋白可能與致