在非多重耐藥陰溝腸桿菌ST84型臨床分離株中發(fā)現(xiàn)blaNDM-1.pdf

1、目的：
　　研究blaNDM-1在陰溝腸桿菌臨床分離株中對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥中的作用。
　　方法：
　　1.對(duì)患者資料進(jìn)行收集和整理以及對(duì)碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌的篩選:對(duì)2012年7月至2013年6月分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的共102株陰溝腸桿菌，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭染色進(jìn)行初步的鑒定，再采用Vitek-2全自動(dòng)微生物分析儀嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn);采用E-test法對(duì)耐藥表型進(jìn)行進(jìn)

2、一步的測(cè)定。
　　2.對(duì)臨床分離的對(duì)碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌耐藥基因型進(jìn)行檢測(cè):采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)檢測(cè)這部分對(duì)碳青霉烯類耐藥或敏感性下降的陰溝腸桿菌是否攜帶blaNDM-1，對(duì)攜帶blaNDM-1的陰溝腸桿菌再依次采用CLSI推薦的雙紙片法來(lái)確定超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的表型，三維試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行AmpC酶的表型檢測(cè)，改良Hodge試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行碳青霉烯酶的表型測(cè)定，雙紙片EDTA協(xié)

3、同法來(lái)進(jìn)行金屬酶的表型檢測(cè)以及PCR方法來(lái)測(cè)定是否攜帶其它的耐藥基因，測(cè)定的耐藥基因包括其它碳青霉烯酶基因、超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因、質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶基因和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因，同時(shí)對(duì)PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，所有的DNA序列均利用NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定基因型。
　　3.耐藥基因的轉(zhuǎn)移:以大腸埃希菌EC600作為受體菌，以攜帶NDM-1基因的陰溝腸桿菌為供體菌進(jìn)行接合

4、試驗(yàn)，對(duì)疑似成功接合的接合子用全自動(dòng)微生物分析儀Vitek-2進(jìn)行菌種鑒定，并用PCR和DNA測(cè)序測(cè)定接合子的耐藥基因。使用QIAGEN(Hilden，Germany)質(zhì)粒中量提取試劑盒來(lái)提取轉(zhuǎn)化接合子的質(zhì)粒DNA，通過(guò)電泳來(lái)對(duì)臨床分離菌株和接合子的質(zhì)粒大小進(jìn)行測(cè)量。
　　4.MLST序列型的分析:根據(jù)陰溝腸桿菌的7個(gè)管家基因來(lái)對(duì)菌株的序列型進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.本研究分離到一株攜帶NDM-1基因的陰溝腸桿菌

5、，該菌株分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科1例重度顱腦損傷伴嚴(yán)重吸入性肺炎患者的痰液標(biāo)本，該患者于2013年3月12日被收治入院，入院后第11天開(kāi)始出現(xiàn)低熱，做痰培養(yǎng)分離出陰溝腸桿菌，被命名為陰溝腸桿菌WZ56。該陰溝腸桿菌WZ56采用E-test法測(cè)定MIC值，參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，除了對(duì)氨曲南敏感外，對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素均表現(xiàn)為耐藥，對(duì)左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素、復(fù)方新諾明、多粘菌素E和替加環(huán)素均表現(xiàn)為敏感。

6、　　2.陰溝腸桿菌WZ56在確定MBLs的雙紙片EDTA協(xié)同試驗(yàn)為陽(yáng)性，ESBLs確定試驗(yàn)為陰性，頭孢西丁三維試驗(yàn)為陰性，改良Hodge試驗(yàn)為陰性。通過(guò)PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌WZ56攜帶blaNDM-1、blaCTX-M-9和qnrA1。接合菌的質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增blaNDM-1、blaCTX-M和qnrA1基因，只有blaNDM-1為陽(yáng)性，未檢測(cè)到blaCTX-M和qnrA1，表明blaNDM-1為質(zhì)粒介導(dǎo)，且bl