水稻鎘結(jié)合蛋白鑒定與分析.pdf

1、水稻植株吸收鎘離子經(jīng)根部質(zhì)外體、共質(zhì)體途徑進(jìn)入維管束系統(tǒng)，通過(guò)木質(zhì)部、韌皮部運(yùn)輸，最終到達(dá)籽粒。在運(yùn)輸過(guò)程中，鎘結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)起到了關(guān)鍵調(diào)節(jié)與運(yùn)輸作用，通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)量是降低水稻籽粒鎘含量，控制鎘對(duì)人類(lèi)危害的可行性途徑。然而僅若干轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白得到鑒定，且功能不明確。目前，鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為鎘結(jié)合蛋白質(zhì)的研究提供了新的探索途徑，但在處理蛋白質(zhì)組時(shí)，去垢劑的除雜是其面臨的技術(shù)難題，且基于固定化螫合金屬柱富集水稻鎘結(jié)合蛋白質(zhì)的方法欠缺。本文針

2、對(duì)鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)去垢劑除雜、鎘結(jié)合蛋白質(zhì)富集方法及其種類(lèi)鑒定進(jìn)行初步研究，旨在建立一種適合水稻蛋白質(zhì)組去除去垢劑以及鎘結(jié)合蛋白質(zhì)富集方法，從而利用建立的方法對(duì)水稻鎘結(jié)合蛋白質(zhì)種類(lèi)進(jìn)行初步探索。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
　　1、建立了基于新型親和去垢小柱去除SDS的方法，為水稻鎘結(jié)合蛋白質(zhì)的研究提夠了必要的技術(shù)支撐。實(shí)驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)性的比較FASP法、親和去垢小柱法和丙酮沉淀法對(duì)SDS去除效率及對(duì)蛋白鑒定結(jié)果的影響，表明親和去垢小柱法

3、極大地簡(jiǎn)化了蛋白樣品制備的步驟，提高了結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)了高通量分析。
　　2、建立了基于Hitrap Chelating HP小柱富集水稻植株中鎘結(jié)合蛋白質(zhì)方法。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化咪唑洗脫濃度、pH、鹽離子濃度以及最終質(zhì)譜上機(jī)濃度，確定了60 mmol/L咪唑作為蛋白質(zhì)洗脫濃度，在不同濃度咪唑洗脫Cd-Hitrap柱，選擇40、60 mmol/L作為中低濃度，300 mmol/L作為高濃度洗脫，洗脫液pH為5.8，NaC1濃度為500

4、 mmol/L，溶解體積為100μL。
　　3、利用所建立樣品前處理的方法，采用NanoLC-LTQ-Orbitrap/Ms對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。采用含60mmol/L咪唑緩沖液洗脫Cd-Hitrap柱，中-67、中-55、晚-78以及L-18葉片依次鑒定到蛋白質(zhì)數(shù)目為176、253、129和109，鑒定到根部蛋白質(zhì)數(shù)目為139、134、136和135。葉片排名前5位的蛋白質(zhì)功能為核苷酸結(jié)合活性(14％)、酶活性(12％)、ADP/A

5、TP結(jié)合活性(9％)、DNA結(jié)合活性(8％)和金屬離子結(jié)合活性(7％)，根部為酶活性(21％)、ADP/ATP結(jié)合活性(16％)、金屬離子結(jié)合活性(11％)、核苷酸結(jié)合活性(9％)和結(jié)構(gòu)分子活性(5％)。葉片前5位蛋白質(zhì)生物學(xué)過(guò)程為轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、細(xì)胞組成和生物合成、代謝過(guò)程、調(diào)控生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞分裂，根部為細(xì)胞組成和生物合成、調(diào)控生物學(xué)過(guò)程、代謝過(guò)程、刺激反應(yīng)和細(xì)胞信號(hào)過(guò)程;葉片中排名前5位亞細(xì)胞位置為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架和葉綠

6、體，根部為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核、細(xì)胞膜和染色質(zhì)。鑒定蛋白質(zhì)依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)和不依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)、錯(cuò)配率(FDR)與匹配肽段數(shù)、誘導(dǎo)離子和目標(biāo)離子進(jìn)行了分析，表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。
　　4、研究了鑒定蛋白質(zhì)鎘結(jié)合強(qiáng)弱及其專(zhuān)一性。結(jié)果表明:在水稻葉片中:在一定程度上僅能結(jié)合CJ+蛋白質(zhì)為15個(gè);結(jié)合Cd2+、Zn2+有5個(gè);結(jié)合Cd2+、Cu2+1個(gè);三種金屬離子均結(jié)合有11個(gè)。水稻根中:在一定程度上僅結(jié)合Cd2+為8個(gè);結(jié)合Cd2+、Zn2+為