Cohn組分Ⅳ中結(jié)合珠蛋白的純化與鑒定.pdf

1、結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp），又稱(chēng)觸珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，主要由肝臟合成。它最主要的功能是與游離的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結(jié)合并促進(jìn)其從循環(huán)系統(tǒng)清除，從而避免對(duì)腎臟的損傷。
　　早在20世紀(jì)50年代，人們就開(kāi)始了以血漿為原料分離純化結(jié)合珠蛋白的研究。然而，純化效率低、成本高影響結(jié)合珠蛋白的規(guī)模化制備。1985年，結(jié)合珠蛋白濃縮制劑在日本上市，用于急性溶血狀態(tài)下一般性治療或者預(yù)防

2、性使用，包括燒傷、燙傷、輸血、體外循環(huán)心臟直視術(shù)等引起的溶血反應(yīng)伴血紅蛋白血癥或血紅蛋白尿，以及手術(shù)干預(yù)前的預(yù)防性使用等。但是，到目前為止，歐洲、美國(guó)和中國(guó)尚無(wú)結(jié)合珠蛋白產(chǎn)品批準(zhǔn)用于臨床。
　　本研究以血漿蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料，探索適于規(guī)?；苽浣Y(jié)合珠蛋白的工藝。研究?jī)?nèi)容主要包括以下五部分：
　　首先，采用SDS-PAGE、免疫印跡及質(zhì)譜分析的方法證明了結(jié)合珠蛋白的確存在于Cohn組分Ⅳ中，明確了其

3、多聚體在非還原性SDS-PAGE中的位置主要位于245kD附近，為后續(xù)分離純化結(jié)合珠蛋白工藝的探索奠定基礎(chǔ)。
　　其次，本文重點(diǎn)從前處理和層析精制兩方面探索分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝。
　　前處理工藝中，根據(jù)Cohn組分Ⅳ中目的蛋白及主要雜蛋白（白蛋白、α1抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等）的分子結(jié)構(gòu)及特性，分別采用PEG沉淀法、硫酸銨沉淀法、利凡諾-鹽析組合法三種方法進(jìn)行前處理，通過(guò)對(duì)比分析具體數(shù)據(jù)，結(jié)果表明利凡諾-鹽析組合法是較為可

4、取的方法，該方法能夠有效去除雜蛋白，以白蛋白等小分子雜蛋白去除效果明顯，并使目的蛋白富集，使后續(xù)層析效果達(dá)到最佳，是一種簡(jiǎn)單、有效的前處理方法，適用于規(guī)?；那疤幚磉^(guò)程。
　　層析分離工藝中，本研究探索三種不同的介質(zhì)（DEAE-Sephrose Fast Flow、QMA Spherosil M、Q-Sepharose Fast Flow）分別在不同pH條件下分離純化結(jié)合珠蛋白的效果。綜合比較發(fā)現(xiàn)，采用 Q-Sepharose F

5、ast Flow層析的分離方法，SDS-PAGE顯示其純度較好，且目的蛋白損失相對(duì)較少。
　　此外，采用利凡諾-鹽析的前處理方法對(duì)結(jié)合珠蛋白進(jìn)行粗純，利用Q-Sepharose Fast Flow層析在pH5.5條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的分離，對(duì)工藝整體進(jìn)行適當(dāng)放大，結(jié)果表明工藝整體較為穩(wěn)定。
　　最后，利用Native-PAGE方法測(cè)的采用該工藝小試和適當(dāng)放大后分離得到的目的蛋白的血紅蛋白結(jié)合活性分別為2.8U/mL（10mg

6、/mL）、3.75U/mL（15mg/mL）。采用免疫印跡及質(zhì)譜分析進(jìn)一步證明該方法成功分離得到目的蛋白。
　　本研究以血液制品生產(chǎn)中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料，探索分離純化結(jié)合珠蛋白的前處理及層析精制工藝，初步建立了利凡諾絡(luò)合-鹽析-Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝，該工藝簡(jiǎn)單，易于放大生產(chǎn)，具有較好應(yīng)用前景。本研究為人結(jié)合珠蛋白的分離純化提供可參考借鑒的數(shù)據(jù)，為建立更加簡(jiǎn)便經(jīng)