施氏鱘卵中雌性蛋白的純化、鑒定及檢測(cè).pdf

1、雌性蛋白，又稱雌性特異蛋白，特異地位于某些雌性卵生動(dòng)物的體內(nèi)，其主要存在于動(dòng)物的組織、器官及血液中。它可共價(jià)結(jié)合糖和磷，非共價(jià)結(jié)合脂，是一種含脂、磷的大分子蛋白，目前研究較多的雌性蛋白主要是卵黃蛋白原。卵黃蛋白原作為卵黃蛋白的前體物質(zhì)，通常是在激素誘導(dǎo)下由肝臟合成，然后通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入卵巢，被正在生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用吸收，并將其降解為卵黃蛋白，它可參與形成卵黃，進(jìn)而為未來(lái)胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和能量需求。魚類的卵黃蛋白純化、鑒定方面研

2、究已有大量的文獻(xiàn)資料，而有關(guān)施氏鱘卵黃蛋白的純化、鑒定及檢測(cè)方面還尚未見報(bào)道。作為黑龍江的特有品種，施氏鱘越來(lái)越受到人們的關(guān)注，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的日漸擴(kuò)大和養(yǎng)殖利潤(rùn)空間的日益縮小，人們將目光更多的投向鱘魚的全雌化生產(chǎn)，而施氏鱘雌性特異蛋白的純化、檢測(cè)方面的研究，便可為這方面提供更多的幫助與支持。 本文以施氏鱘卵巢卵為實(shí)驗(yàn)材料，用Sephadex G-100凝膠過(guò)濾柱和DEAE Sephadex．A25離子交換柱首次純化得到施氏鱘一

3、種雌性特異的卵黃蛋白，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)只顯示一條蛋白帶，說(shuō)明純化所得的物質(zhì)就是施氏鱘的卵黃蛋白，而變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)則出現(xiàn)兩條蛋白帶，這表明該施氏鱘卵黃蛋白有兩個(gè)蛋白亞基，其分子量分別為109KDa和98 KDa。將天然電泳后的凝膠分別利用油紅O進(jìn)行脂蛋白特異性染色和羅丹明B進(jìn)行磷蛋白特異性染色，結(jié)果顯示凝膠與這兩種試劑均出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，從而說(shuō)明該施氏鱘卵

4、黃蛋白是一種富含脂、磷的大分子蛋白。 用純化得到的施氏鱘卵黃蛋白與佐劑混勻后注射到新西蘭大白兔體內(nèi)來(lái)制備多克隆抗體，利用免疫雙擴(kuò)散的方法測(cè)得其抗血清效價(jià)為1：16。將所得的抗血清用硫酸氨分步鹽析法進(jìn)行純化濃縮，通過(guò) Western blotting方法來(lái)檢測(cè)所得抗體的特異性，結(jié)果表明施氏鱘卵黃蛋白的抗體具有較好的特異性，可用于下面的實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)免疫雙擴(kuò)散還發(fā)現(xiàn)，在通常條件下卵黃蛋白具有明顯的性別特異性和種特異性。 取4

5、齡施氏鱘雌魚的肝臟、腸、性腺及血液，分別制成石蠟切片和血涂片，然后運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)施氏鱘體內(nèi)卵黃蛋白的代謝途徑，進(jìn)而為施氏鱘的全雌化生產(chǎn)提供幫助。結(jié)果顯示施氏鱘卵黃蛋白只存在于肝臟和血液中，而在腸道和性腺則沒有發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白的存在，從而說(shuō)明施氏鱘體內(nèi)卵黃蛋白的代謝途徑存在外源性這種方式。在這種途徑的代謝過(guò)程中，卵黃蛋白的前體物質(zhì)一卵黃蛋白原首先在肝臟中大量合成，然后通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)铰殉玻谀抢锉宦涯讣?xì)胞通過(guò)胞飲作用吸收，最終