蜂王漿主蛋白1--3的純化鑒定及在儲存過程中變化.pdf

1、蜂王漿具有許多益于人類健康的生物學(xué)功能，蜂王漿主蛋白(MRJPs)作為蜂王漿中含量最多的特征性成分，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重點。因此本課題以西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂王漿為原料，建立一套逐步分離純化天然狀態(tài)下MRJP1-3的流程，并首次利用高靈敏度的高效液相對分離純化后的單一蛋白進行純度鑒定，同時研究了蜂王漿蛋白在儲存過程中的變化，結(jié)果如下。
　　1.使用疏水色譜柱、尺寸排阻色譜柱和陽離子交換色譜柱三種色譜柱，建立了一

2、套MRJP1-3的純化流程。首先使用Hitrap Butyl-HP疏水色譜柱對蜂王漿粗提液進行分離，得到含有MRJP2和MRJP3的穿透組分，和依次被洗脫的MRJP1寡聚體組分和MRJP1單體組分;然后對兩個MRJP1組分分別使用HiLoad X16/60 Superdex200 pg尺寸排阻色譜柱進行純化，得到了MRJP1寡聚體1、MRJP1寡聚體2和MPJP1單體;最后使用Toyopearl GigaCap S-650M陽離子交換色

3、譜柱對來自第一步疏水色譜層析的穿透組分進行分離，得到了MRJP2和MRJP3。
　　2.通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)對五個純化好的單一主蛋白進行鑒定，其中MRJP1寡聚體1、MRJP1寡聚體2、MRJP1單體、MRJP2和MRS3的序列覆蓋率分別為:92.13％、76.62％、91.2％、87.39％和64.71％。其中670 kDa蛋白首次被純化并鑒定為MRJP1寡聚體。使用SEC-HPLC對這五個單一蛋白

4、進行了純度鑒定，結(jié)果分別為89.88％、67.79％、99.92％、99.41％和99.97％。
　　3.利用分析超速離心方法，對MRJP1寡聚體進行精確的分子量測定，結(jié)果表明MRJP1含有三個寡聚體，分別是228 kDa的MRJP1寡聚體1、408 kDa的MRJP1寡聚體2和639 kDa的MRJP1寡聚體3，均由MRJP1單體和Apisimin組成。我們推測MRJP1寡聚體2和3分別為MRJP1寡聚體1的二倍體和三倍體。根據(jù)

5、中低壓尺寸排阻色譜，Native-PAGE電泳和質(zhì)譜結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MRJP1是蜂王漿中含量最多的蛋白，在天然狀態(tài)下MRJP1在蜂王漿中主要以寡聚體形式存在，228 kDa的MRJP1寡聚體1的含量最多，MRJP1單體的含量很少。
　　4.利用同步輻射真空紫外圓二色譜技術(shù)對五個單一主蛋白在25℃下進行二級結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果表明天然狀態(tài)下，MRJP1-3主要以β折疊和無規(guī)則卷曲組成，α螺旋很少。
　　5.結(jié)合電泳分析、蛋白酶解法、茚

6、三酮法、全自動氨基酸分析等技術(shù)，確定了蜂王漿蛋白在SEC-HPLC上的9個色譜峰，即峰1主要為MRJP1寡聚體2，峰2主要為MRJP1寡聚體1，峰3主要為MRJP3，峰4主要為MRJP2和少量的MRJP1單體，峰5-9為一些游離氨基酸和小肽。
　　6.使用高效液相尺寸排阻色譜(SEC-HPLC)分析在不同儲存條件下蜂王漿蛋白的變化，結(jié)果表明:新鮮蜂王漿在冷凍（-18℃）儲存6個月內(nèi)蛋白成分基本無變化;在4℃下儲存1個月后，蛋白成分

7、出現(xiàn)緩慢變化;在室溫下儲存一個月內(nèi)，就會出現(xiàn)較為明顯的成分變化。在室溫和4℃條件下隨著儲存時間的延長，670 kDa、290 kDa MRJP1寡聚體和MRJP1單體呈現(xiàn)下降趨勢，而新出現(xiàn)的700 kDa和440 kDa寡聚體呈現(xiàn)上升趨勢。另外，通過SEC-HPLC檢測蜂王漿蛋白，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蜂王漿中主蛋白峰1面積比小于0.50，峰2面積比大于0.55，峰N面積比小于0.02時，可以認為蜂王漿是新鮮的。因此我們建立了一個基于SEC-HPLC檢