中華蜜蜂王漿抗菌肽Acc-royalisin原核表達及抑菌活性研究.pdf

1、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國土生土長的蜂種，其抗病性明顯優(yōu)于西方蜜蜂(Apismellifera)。蜂王漿是哺育工蜂的咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體分泌的乳狀、具有生物活性的活性物質。近期的研究表明，中華蜜蜂抗病性優(yōu)于西方蜜蜂以及蜂王漿不易變質的特性都與中華蜜蜂王漿抗菌肽Apis cerana cerana—royalisin(Acc—royalisin)有關。Prepro—Acc—royalisn(PPAR)是

2、Acc—royalisin前體，Mature Acc—royalisin(MAR)為Acc—royalisin的成熟肽部分。
　　 1．Prepro—Acc—royalisn原核表達及多克隆抗體的制備
　　 以含蜂王漿抗菌肽Prepro—Acc—royalisn(PPAR)基因的中華蜜蜂頭部cDNA文庫質粒為模板，用PCR方法擴增出其前體片段，將該片段克隆入表達載體pGEX—4T—2，其C端與GST連接。在大腸桿菌BL2

3、1中與GST進行融合表達。利用割膠回收獲得目的蛋白注射兔子，制備多克隆抗體。SDS—PAGE和薄層掃描分析結果表明：該基因得到高效表達，表達產物大小約為46kDa，占細胞總蛋白的16.3％。利用所獲抗體對純化PPAR融合蛋白進行Western blot印跡分析，獲得特異性條帶。結果證明，該抗體可用于檢測Acc—royalisin的存在。
　　 2．Mature Acc—royalisin的原核表達及表達產物可溶性分析
　　

4、 本試驗完成了對Mature Acc—royalisin(MAR)的基因克隆、原核表達及產物的可溶性分析。Westernbolt分析結果表明MAR成功在大腸桿菌中成功的與GST進行了融合表達，表達的GST—MAR占表達總蛋白的18.6％，其中可溶性部分占90％以上。
　　 3．GST—Prepro—Acc—royalisn、GST—Acc—royalisin純化及Acc—royalisin蛋白的獲得
　　 本實驗利用G

5、enScript Corporation蛋白純化試劑盒，將獲得的GST—PPAR及GST—MAR的基因表達產物進行純化，分別在500mL的菌液中純化出0.0134g及and0.0206g蛋白。Westernbolt印跡表明，純化的三種蛋白GST—PPAR、GST—MAR和GST均對GST一抗產生了很強的特異性的反應，證明GST—PPAR、GST—MAR融合蛋白純化成功。同時，將純化后的GST—MAR用凝血酶酶切獲得了單體MAR。

6、　　 4．Acc—royalisin重組表達產物對革蘭氏陽性細菌的抑菌活性研究
　　 用GST—PPAR，PPAR及MAR的純化產物分別對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，黃色微球菌Micrococcus luteus和枯草芽孢桿菌Bacillus subalis．進行了抑菌試驗，結果表明：三種純化產物對這三類革蘭氏陽性菌均有拮抗作用，且效果明顯，與屬于具有防腐功能的商品化食品添加劑—抗菌