Cohn氏法組分Ⅳ中血漿蛋白C兩種成分的研究.pdf

1、目的：本實驗室前期實驗發(fā)現(xiàn)：采用固定化金屬螫合親和層析(ImmobilizedMetalAffinityChromatography，IMAC)，從血漿蛋白分離Cohn氏法組分Ⅳ(CohnFractionⅣ，CFⅣ)純化蛋白C(ProteinC，PC)過程中，以咪唑(Imidazole)緩沖液進行階段洗脫時，在低濃度(0.008mol/L)和高濃度(0.040mol/L)的咪唑緩沖液作用下，蛋白洗脫峰分別具有較高的PC抗原性和PC活性，

2、而在中間濃度(0.015mol/L)的咪唑緩沖液作用下，蛋白洗脫峰雖具有較高的PC抗原性，但PC活性較低。從該現(xiàn)象推測，CFⅣ中可能含有性質(zhì)差異較大的PC活性成分，這在國內(nèi)外未曾見報道。本實驗旨在探明其原因，為PC制品的制備和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)用離子交換層析初步純化CFⅣ中的PC后，①重復原來的IMAC實驗；②設(shè)計新的IMAC洗脫方案：采用0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.

3、300mol/L的咪唑洗脫濃度。
　　 (2)用發(fā)色底物法檢測PC活性。
　　 (3)用WesternBlot方法證明PC特異性。
　　 (4)用毛細管區(qū)帶電泳（CapillaryZoneElectrophrosis，CZE）分析前后兩種IMAC洗脫方案中的各洗脫峰。
　　 (5)用免疫親和層析(ImmuneAffinityChromatography，IAC)純化IMAC中PC差異顯著的洗脫峰。

4、　　 (6)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)分析PC差異成分，獲得質(zhì)譜圖，并從生物信息學角度分析原因。
　　 結(jié)果：(1)PC活性檢測顯示：①原來的IMAC實驗中，0.008mol/L、0.015mol/L、0.040mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性分別為（75.941±3.010）％、（5.592±1.410）%、（42.334±2.821）%；0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性與0.008mo

5、l/L和0.040mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性進行t檢驗，P值均小于0.05，有顯著性差異。②新的IMAC洗脫方案中，0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.300mol/L的咪唑緩沖液洗脫的PC活性分別為（73.411±2.076）%、（54.694±1.692）%、(31.610±1.118)%和(30.557±2.553)%；0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的PC活性與0.300mol/L的咪

6、唑緩沖液洗脫的PC活性進行t檢驗，P值小于0.05，有顯著性差異。
　　 (2)WesternBlot結(jié)果顯示：①用0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫的蛋白洗脫峰僅在52KDa處有一條蛋白曝光帶(smallPC，sPC)；其他濃度的咪唑緩沖液洗脫的蛋白洗脫峰在62KDa處有一條蛋白曝光帶(bigPC，bPC)；②在110KDa處，CFIV來源的所有樣品都有一條蛋白曝光帶。
　　 (3)CZE結(jié)果顯示：0.015mol/L

7、咪唑緩沖液洗脫液中的PC在遷移時間為(10.467±0.016)min和（11.333±0.009）min時出峰，在(10.667±0.024)min和（16.167±0.012）min時不出峰。0.300mol/L咪唑緩沖液洗脫液中的PC的在上述遷移時間的出峰情況與前者相反。
　　 (4)0.015mol/L咪唑緩沖液洗物經(jīng)IAC純化，得到以sPC為主要成分的濃縮物，PC活性為（41.903±1.900）%；0.300mol/

8、L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化，得到以bPC為主要成分的濃縮物，PC活性為(1238.523±3.996)%。兩樣品PC活性進行t檢驗，P值小于0.05，具有顯著性差異。
　　 (5)HPLC-MS/MS顯示：0.015mol/L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化后的樣品為PC，Mascot積分為379;0.300mol/L咪唑緩沖液洗脫物經(jīng)IAC純化后的樣品同樣為PC，Mascot積分為809。
　　 (6)生物信息學結(jié)果顯

9、示：①sPC與bPC的PC匹配肽相比較，有4個相同肽段、1個較短肽段和3個缺失肽段；110KDa對曝光的蛋白條帶具有6個PC匹配肽。②sPC的PC匹配肽中含有3個組氨酸和4個色氨酸，bPC的PC匹配肽中分別含有6個組氨酸和6個色氨酸。
　　 結(jié)論：(1)CFⅣ中存在活性差異較大的兩種PC成分。大分子量的bPC活性高，小分子量的sPC活性低。
　　 (2)sPC與bPC中肽段的差異，是兩種PC成分具有不同活性的原因。