糖蛋白pIgR兩種新功能的發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、多聚免疫球蛋白受體(pIgR)屬于I型跨膜糖蛋白,可以與多聚免疫球蛋白A和多聚免疫球蛋白M特異性結(jié)合,通過穿胞轉(zhuǎn)運,將它們從上皮細(xì)胞基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運到頂膜,并最終分泌到外分泌液中去。pIgR通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運,可以在粘膜的腔面阻止病原體粘附,在上皮細(xì)胞內(nèi)中和病毒,也可以將固有層內(nèi)的抗原分泌出去。因此,pIgR的有效分泌是多聚免疫球蛋白發(fā)揮粘膜防御功能的必要條件,在粘膜免疫中起著舉足輕重的作用。最初對人小腸粘膜的免疫組織化學(xué)研

2、究發(fā)現(xiàn):人小腸pIgR分布于柱狀吸收細(xì)胞,尤其是那些分布在腸隱窩內(nèi)的吸收細(xì)胞,而潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)有pIgR的存在。幾十年來人們普遍認(rèn)為在小腸,只有柱狀吸收細(xì)胞可以合成pIgR、介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運并分泌sIgA。然而,有研究表明:在大鼠小腸組織中,pIgR的免疫組織化學(xué)陽性染色特異性地位于潘氏細(xì)胞內(nèi),提示潘氏細(xì)胞與pIgR有一定的關(guān)聯(lián)。潘氏細(xì)胞是存在于腸隱窩底部的錐形細(xì)胞,已經(jīng)證實潘氏細(xì)胞有許多功能,如分泌磷脂酶A2、溶

3、菌酶、防御素(defensins)、抗菌肽等,這些物質(zhì)是腸道先天性免疫的重要基礎(chǔ)。近年來的研究表明,潘氏細(xì)胞在炎癥性腸道疾病(IBD)的發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用。潘氏細(xì)胞是否合成pIgR并參與IgA的轉(zhuǎn)運,對于IBD的發(fā)生機制研究及臨床治療手段的改進而言,具有重要的科學(xué)意義。本論文首先采用分子生物學(xué)的方法,轉(zhuǎn)錄合成了特異性針對大鼠與人pIgR的分子探針;然后采用熒光雙標(biāo)記原位雜交和熒光雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)的方法,結(jié)合潘氏細(xì)胞的特異性蛋白標(biāo)

4、志物-溶菌酶,檢測了大鼠和人小腸組織中pIgR的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。實驗結(jié)果顯示:大鼠與人潘氏細(xì)胞內(nèi)均可以檢測到pIgR的mRNA和蛋白質(zhì),提示潘氏細(xì)胞可以合成pIgR。本論文又采用熒光雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)和免疫膠體金電鏡的方法,檢測了潘氏細(xì)胞與小腸IgA分布之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):潘氏細(xì)胞的分泌顆粒和細(xì)胞基底膜上均含有大量的IgA,提示潘氏細(xì)胞所合成的pIgR可能參與IgA的轉(zhuǎn)運。在大鼠小腸中,只有潘氏細(xì)胞內(nèi)能夠合成pIgR,而在人

5、小腸中潘氏細(xì)胞和腸腺吸收細(xì)胞均可以合成pIgR,這表明大鼠與人小腸IgA的轉(zhuǎn)運途徑可能不一致。雖然多聚免疫球蛋白受體(pIgR)在粘膜免疫中起著至關(guān)重要的作用,但有報道指出該蛋白在體內(nèi)的功能具有多面性。研究表明某些上皮腫瘤組織和細(xì)胞中pIgR的表達(dá)量高于正常組織或細(xì)胞,提示pIgR過表達(dá)可能與上皮來源腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。但是迄今為止,pIgR能否成為腫瘤的Marker或者成為腫瘤治療的分子靶點目前尚未見報道。發(fā)現(xiàn)及闡明pIg

6、R在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中的重要作用,將對腫瘤這一人類尚未克服的疑難病癥的診斷及治療具有深遠(yuǎn)的意義。本論文首先利用真核轉(zhuǎn)染技術(shù),成功構(gòu)建了人pIgR穩(wěn)定高表達(dá)的MDCK細(xì)胞株,然后對細(xì)胞的特性進行觀察與比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,pIgR過表達(dá)的MDCK細(xì)胞生長速度明顯加快,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變,細(xì)胞容易被胰酶消化提示粘附力降低。本論文利用SRB法、PI染色法、western blotting方法以及平皿克隆生長實驗方法對有關(guān)細(xì)胞增殖的特征

7、性指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果顯示:人pIgR過表達(dá)可以使MDCK細(xì)胞的增殖能力顯著增強,細(xì)胞周期進程加快,細(xì)胞增殖指數(shù)明顯升高,PCNA表達(dá)量增高,ERK1/2磷酸化顯著增強,而且單個細(xì)胞生長能力增強。在上皮細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞與基質(zhì)的粘附力下降的發(fā)生機制中,上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)往往起著至關(guān)重要的作用。EMT的主要特征有細(xì)胞粘附分子(如E-鈣粘素)表達(dá)的減少、細(xì)胞骨架發(fā)生變化、形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等。這種轉(zhuǎn)換允許上皮細(xì)胞擺脫細(xì)胞

8、-細(xì)胞間連接,而表現(xiàn)得更具侵襲性。本論文又利用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、transwell小室法對EMT相關(guān)的指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果顯示:人pIgR過表達(dá)的MDCK細(xì)胞形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征,細(xì)胞骨架發(fā)生改變,具有粘附力下降、遷移和侵襲能力增強等EMT細(xì)胞行為學(xué)特征,并且有E鈣粘素減少這一典型EMT分子特征。軟瓊脂克隆形成實驗進一步表明:人pIgR過表達(dá)的MDCK細(xì)胞具備了一定的體外成瘤能力。上述結(jié)果表明,糖蛋白pIgR高表達(dá)具有明顯的