Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細(xì)胞及其IBDV結(jié)合區(qū)的初步研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以嚴(yán)重免疫抑制和青年雞死亡率高為主要特征，對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。病毒感染的第一步是病毒與靶細(xì)胞受體的結(jié)合，因此研究IBDV受體對(duì)揭示病毒-細(xì)胞相互作用非常關(guān)鍵。熱應(yīng)激蛋白90α(Heat shock protein90α，Hsp

2、90α)是細(xì)胞適應(yīng)株IBDV感染雞成纖維細(xì)胞的受體之一或受體復(fù)合物成分，但在野毒株IBDV感染雞法氏囊細(xì)胞中的作用尚不清楚。類(lèi)彈性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）具有溫度敏感可逆相變特性，在低于其相變溫度的溶液中呈溶解狀態(tài)，高于相變溫度的溶液中呈凝聚狀態(tài)，因此可用簡(jiǎn)單的離心法進(jìn)行其融合蛋白的分離純化。本課題組將ELP的相變特性與病毒受體結(jié)合特異性相結(jié)合，建立的病毒受體結(jié)合捕捉技術(shù)可用于腺病毒的濃縮、純

3、化和監(jiān)測(cè)。本研究利用相同原理，將雞Hsp90α及其cDNA片段與ELP進(jìn)行融合表達(dá)，旨在探明Hsp90α的IBDV結(jié)合區(qū)，并為建立IBDV濃縮與純化方法奠定基礎(chǔ)。
　　為了初步確定Hsp90α的IBDV結(jié)合區(qū)，用RT-PCR從雞胚成纖維細(xì)胞擴(kuò)增Hsp90α全長(zhǎng)cDNA及其N(xiāo)端284個(gè)氨基酸編碼序列和C端444個(gè)氨基酸編碼序列，分別插入含ELP編碼序列的原核表達(dá)載體pET-ELP;分別將重組質(zhì)粒pET-ELP-Hsp90α、pET-

4、ELP-N284和pET-ELP-C444轉(zhuǎn)化BLR(DE3)大腸桿菌，在20℃用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，在優(yōu)化條件下用ELP的溫度敏感逆向相變循環(huán)(ITC)純化融合蛋白;將純化的融合蛋白與IBDV孵育結(jié)合，用RT-PCR檢測(cè)病毒是否與重組Hsp90α及其片段結(jié)合。結(jié)果顯示:ELP與Hsp90α及其片段融合蛋白均為可溶性表達(dá);ELP-Hsp90α和ELP-C444融合蛋白能與IBDV結(jié)合，而ELP-N284融合蛋白不能與IBDV結(jié)合，

5、表明Hsp90α的IBDV結(jié)合區(qū)位于C端444個(gè)氨基酸區(qū)域。
　　為了探明Hsp90α是否參與野毒株IBDV感染雞法氏囊細(xì)胞，從SPF雞胚分離培養(yǎng)法氏囊細(xì)胞，分別用RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)Hsp90α表達(dá)，以法氏囊細(xì)胞系DT40細(xì)胞和成纖維細(xì)胞系DF-1細(xì)胞為對(duì)照，結(jié)果顯示法氏囊細(xì)胞系及原代細(xì)胞均表達(dá)Hsp90α分子;分別用重組Hsp90α孵育IBDV和Hsp90α抗體孵育法氏囊細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)和病毒滴定檢測(cè)結(jié)果顯