雞干擾素刺激基因IFIT5和Viperin在IBDV感染宿主細胞中的作用機制研究.pdf

1、傳染性法氏囊病是一種危害3～6周齡雛雞的急性、高度接觸性傳染疾病，該病的病原傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要攻擊法氏囊中未成熟的B淋巴細胞，造成雞嚴重的免疫抑制。IBDV是一種雙股雙節(jié)段RNA病毒，其基因組包括A、B兩個節(jié)段，編碼VP1～VP5五種病毒蛋白。IBDV感染會影響干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)的表達，但目前針對IBDV與ISG之間關系的研究還較少。本課題以兩個IBDV感染

2、時上調的ISGs(IFIT5和Viperin)作為研究對象，分析了其在IBDV感染過程中的作用。
　　IFIT5是雞IFIT家族的唯一成員，本實驗室前期的蛋白質組學數(shù)據(jù)表明，在IBDV感染的DF-1細胞中IFIT5呈上調表達，但目前該基因在Genbank中仍處于預測狀態(tài)，未見有關該基因的功能報道。本研究從IBDV感染的DF-1細胞中克隆了雞IFIT5基因，其全長為1440bp，編碼480個氨基酸。生物信息學分析顯示其具有IFIT家

3、族蛋白共有的六個典型TPR結構域。進化分析顯示，雞IFIT5與火雞IFIT5的氨基酸同源性最高，與魚類的親緣關系最遠。應用原核表達的雞IFIT5蛋白制備的多克隆抗體，證明poly(I∶C)、IFN-α和IFN-β均可在基因和蛋白水平誘導雞IFIT5表達，并證實IFIT5與Mda5之間的相互作用。另外，干擾雞IFIT5能夠抑制IFN-β的產生。
　　為研究雞IFIT5與IBDV感染的關系，對IBDV感染后雞IFIT5的動態(tài)表達進行了

4、分析。結果顯示，IBDV感染確實能夠引起雞IFIT5在體內外上調表達，且呈IBDV感染劑量依賴性。進一步對IBDV的各編碼蛋白及基因組進行過表達并檢測雞IFIT5的變化，發(fā)現(xiàn)引起雞IFIT5上調的病毒因子是病毒蛋白VP1和病毒基因組dsRNA。然而，無論過表達還是干擾雞IFIT5，IBDV的病毒蛋白及病毒滴度均無明顯變化，說明雞IFIT5沒有影響IBDV的復制，同時也提示IBDV可能以某種機制逃逸了IFIT5的抗病毒作用。作為另一個具有

5、抗病毒活性的ISG，Viperin在IBDV感染后也會被刺激上調。在此也對Viperin進行了過表達，并分析其對IBDV復制的影響。與IFIT5相似，雞Viperin并不影響IBDV在DF-1細胞中復制，但人Viperin卻能顯著抑制IBDV在293T細胞的復制。進一步究其原因，發(fā)現(xiàn)Viperin對細胞自噬水平無影響，但可以增強293T細胞的凋亡，因此推測Viperin可能是通過誘導凋亡來限制IBDV在293T細胞復制。
　　除先

6、天免疫外，細胞自噬也是機體對抗病毒感染的一條途徑，但長期的協(xié)同進化使病毒具有了對抗自噬的能力。在此，分析了IBDV病毒蛋白VP4與自噬的關系，結果發(fā)現(xiàn)VP4可分布于自噬泡周圍，但與自噬泡標志物LC3不存在互作。過表達VP4能夠促進LC3由Ⅰ型向Ⅱ型轉換，并導致P62累積，說明自噬被VP4所抑制。進一步證明VP4可以與自噬相關蛋白Beclin-1共定位并互作，提示VP4可能通過Beclin-1阻斷了自噬泡與溶酶體的融合或自噬泡在溶酶體中的