干擾素作用下乙型肝炎病毒c基因區(qū)變異機制的體外研究及hepg2.2.15細胞在研究中的應用

1、中山大學碩士學位論文干擾素作用下乙型肝炎病毒C基因區(qū)變異機制的體外研究及HepG2.2.15細胞在研究中的應用姓名：邵光申請學位級別：碩士專業(yè)：消化內科學指導教師：周曉東20040526下擾素忤I L J F 己1 ¨_ 病毒c 基訓匹變異機制的體外研究及J | c p G 2 2 ．I5 細胞在研究中的應用 中文摘要％，停藥后隨訪5 —1 0 年，H B e A g 及H B V D N A 陰轉率可增至6 0 ％一7 0

2、％，治療后有應答者( H B e A g 及H B V D N A 陰轉) 預后較好[ 2 ] ，可以減少肝硬化及肝細胞癌的發(fā)病率。臨床研究發(fā)現(xiàn)經干擾素治療的乙肝患者會出現(xiàn)H B V C 基因區(qū)，前c 區(qū)， c 基因啟動子突變，關于干擾素作用下H B V 的突變機制，大多數(shù)學者通過臨床觀察認為是H B V 逃避機體免疫壓力的結果，但是有學者研究發(fā)現(xiàn)c 基因熱點變異區(qū)均不在M H C 限制性C T L 識別區(qū)，最常見的L 9 7 替代甚至

3、與已知的T 或B 表位無關，因此將干擾素治療后新產生的H B V 變異完全歸兇于免疫因素是不嚴謹?shù)?。鑒于上述，我們去除免疫因素的影響，采用細胞模型就干擾素作用下乙肝病毒C 區(qū)，前c 區(qū)的突變規(guī)律及機制展開系統(tǒng)的體外研究，以探討干擾素直接抗病毒作用與H B V 變異的關系。前期的試驗結果表明：1 ．在高劑量條件N I F N 一Ⅱ選擇下，能檢測到H e p G 2 ．2 ．1 5 H B V 前C ／C 基因插入或缺失突變株，突變株與優(yōu)勢

4、株相比基因序列同源性在9 7 ％以上，因此，可以認為該突變株與優(yōu)勢株同源．；2 ．h l F N ．a 可通過直接分子作用機制影響H e p G 2 ．2 ．1 5H B V 的c c c D N A 轉錄后調節(jié)機能，導致前C ／C 基因結構的改變．同時，也可能通過直接病毒抑制作用，抑制H e p G 2 ．2 ．1 5H B V 優(yōu)勢株度的復制，從而導致突變株比例相對增加；3 ．存在H B V 異質性H e p G 2 ．2 ．1 5

5、 細胞系可作為H B V 變異分子機制研究的理想細胞模型，這種細胞模型內存在異質性的現(xiàn)象可能會影響其在基因治療中的應用。本實驗在前期工作的基礎上進一步探討干擾素真接抗病毒的分子機制及其致H B V 變異機制及H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞在H B V 基因變異機制研究中的應用價值。研究目的：1 ．用不同劑量I F N 常時間作用于H B V 分泌型H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞培養(yǎng)株；通過定量檢測不同時相細胞培養(yǎng)上清

6、@ H B e A g 、H B V D N A ，探討H B V 基因變異對病毒蛋白合成及病毒復制的影響；通過測序的方法鑒定高劑量組細胞培養(yǎng)上清H B V D N A及細胞內H B v 前基因組R N A C 基因區(qū)變異；用c l u s t a l x 、b l a s t 等軟件綜合分析其突變的規(guī)律及意義，為探討I F N 致H B V C 基因變異的多重機制提供科學的依據(jù)。2 ．探討H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞株在H