GAGA樣元件結(jié)合蛋白的篩選克隆及其對(duì)Hsp90基因調(diào)控作用的初探.pdf

1、熱休克蛋白家族成員中的分子量為90kD的熱休克蛋白(Hsp90)是真核細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一.Hsp90能使在熱休克等應(yīng)激反應(yīng)中積累的誤折疊蛋白重新折疊,并可促進(jìn)已變性的蛋白質(zhì)降解.Hsp90還參與激素受體、某些轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)途徑和翻譯起始階段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和活性調(diào)節(jié).因此Hsp90在真核細(xì)胞中有著廣泛而重要的功能.利用含有GAGA元件核心序列的寡核苷酸片段作探針,與42℃熱休克處理前后的Jurkat細(xì)胞核抽提物

2、進(jìn)行電泳遷移率變更分析(EMSA)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在熱休克前后均出現(xiàn)特異結(jié)合帶,而且在熱休克后更明顯,提示在人Jurkat細(xì)胞核抽提物中可能存在GAGA樣元件的特異結(jié)合蛋白,并且在熱休克時(shí)結(jié)合活性增加.為篩選人Jurkat細(xì)胞中GAGA樣元件的結(jié)合蛋白,我們采用酵母單雜交體系對(duì)人Jurkat細(xì)胞MATCHMAKER cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選,結(jié)果出現(xiàn)63個(gè)His<'+>陽(yáng)性克隆.進(jìn)一步進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析,發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)克隆顯示較強(qiáng)的β-半

3、乳糖苷酶活性.為探討GLBP1蛋白對(duì)hsp90基因的調(diào)控功能,我們首先通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,建立了定量檢測(cè)應(yīng)激基因啟動(dòng)子活性的競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR的體系.由于熒光素酶對(duì)熱休克非常敏感,不適用于激(熱休克)基因調(diào)控的研究.而氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)是一種非常穩(wěn)定的蛋白,在60℃,10min的條件下仍保持酶活性,所以CAT基因更適用于研究熱休克基因啟動(dòng)子活性.同時(shí)檢測(cè)CAT活性的經(jīng)典方法所得的結(jié)果不僅反映基因轉(zhuǎn)錄、mRNA的穩(wěn)定性，也反映了

4、翻譯及翻譯后水平的調(diào)控，所以我們建立了用RT-PCR直接檢測(cè)CAT報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄本（mRNA)水平的體系.分別將編碼GLBP1蛋白正義及反義cDNA真核表達(dá)質(zhì)粒分別與人hsp90α或hs90β基因上游調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的CAT報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,利用競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR方法檢測(cè)啟動(dòng)子活性.為了在體外重建染色質(zhì)結(jié)構(gòu),我們應(yīng)用昆蟲(chóng)表達(dá)體系表達(dá)并純化了染色質(zhì)組裝因子ACF及NAP-1蛋白;并從小牛胸腺水牛胸腺組織中純化了核心組蛋白,從而為進(jìn)